Evaluación de tumor infiltrante de leucocitos subconjuntos en un modelo de tumor subcutáneo
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Células inmunes especializadas que se infiltran en el microambiente tumoral regulan el crecimiento y la supervivencia de neoplasia. Las células malignas deben eludir o subvertir las respuestas inmunitarias antitumorales con el fin de sobrevivir y prosperar. Los tumores se aprovechan de una serie de diferentes mecanismos de inmunidad "escape", incluyendo la contratación de tolerogénica DC, las células T reguladoras inmunosupresores (Treg), y células supresoras de origen mieloide (MDSC) que inhiben las respuestas antitumorales citotóxicos. Por el contrario, las células inmunes efectoras anti-tumor pueden ralentizar el crecimiento y expansión de tumores malignos: células dendríticas inmunoestimuladoras, células asesinas naturales que albergan la inmunidad anti-tumor innata, y células T citotóxicas todos pueden participar en la supresión de tumores. El equilibrio entre pro y anti-tumorales leucocitos determina en última instancia, el comportamiento y el destino de las células transformadas; una multitud de estudios clínicos en humanos han apoyado esto. Así, el análisis detallado de subconjuntos de leucocitos dentro deel microambiente tumoral se ha vuelto cada vez más importante. Aquí, se describe un método para el análisis de subconjuntos de leucocitos infiltrantes presentes en el microambiente tumoral en un modelo de tumor de ratón. Las células tumorales de melanoma de ratón B16 se inocularon por vía subcutánea en ratones C57BL / 6. En un momento determinado, los tumores y la piel circundante fueron resecadas en bloque y se procesan en suspensiones de células individuales, que luego se tiñeron de múltiples colores citometría de flujo. Usando una variedad de marcadores de subconjuntos de leucocitos, hemos sido capaces de comparar los porcentajes relativos de la infiltración de subconjuntos de leucocitos entre el control y los tumores chemerin expresan. Los investigadores pueden utilizar una herramienta para estudiar la presencia inmune en el microambiente tumoral y cuando se combina con mediciones del tamaño de la pinza tradicionales de crecimiento del tumor, potencialmente les permita dilucidar el impacto de los cambios en la composición inmunológico sobre el crecimiento tumoral. Dicha técnica se puede aplicar a cualquier modelo de tumor en el que el tumor y su microambiente cun ser resecados y procesados.
Introduction
El equilibrio entre el crecimiento del tumor y la promoción y la regresión es, en parte, depende de la balanza de leucocitos infiltrantes de tumores favor y en contra presentes en el microambiente 1,2. Con el fin de estudiar el microambiente tumoral (TME) y, específicamente, identificar las subpoblaciones de leucocitos de infiltración, hemos desarrollado un método para la evaluación de tumores subcutáneos en un modelo de tumor murino. La importancia de estudiar el microambiente tumoral es bien conocido y apoyado en la literatura. Numerosos estudios han demostrado que el equilibrio de las células inmunes pro- y anti-infiltrantes de tumores puede afectar los resultados del crecimiento del tumor, no sólo en el ratón, sino también los estudios en humanos (revisado en 3,4). Por ejemplo, Curiel et al. Mostró que empeoraron los resultados clínicos en pacientes con cáncer de ovario se correlacionaron con la presencia de aumento de porcentajes de células infiltrantes de tumor T reguladoras CD4 + (Tregs) 5. Nuestro propio trabajo también mostró el efecto de un novel de leucocitos quimioatrayente de la proporción de subconjuntos de leucocitos en un modelo de melanoma de ratón 6, que también se correlaciona con una disminución de crecimiento del tumor. Por lo tanto, los análisis detallados de los subconjuntos de leucocitos dentro de un tumor es ahora más ampliamente reconocidos y cada vez más importante.
Hay muchas maneras de evaluar el microambiente tumoral para la infiltración de leucocitos; por ejemplo grupos han diseñado ratones transgénicos para expresar diversas proteínas fluorescentes en orden a la imagen de la TME 7, inmunohistoquímica clásica e inmunofluorescencia de secciones conservadas 8, incluyendo varias técnicas de imagen como la resonancia magnética, PET, microscopía confocal 09.11 – algunas de ellas con la capacidad de monitorear intravitally 10,12. Éstos se pueden utilizar con diversos agentes de formación de imágenes moleculares, tales como nanopartículas 13 o agentes de contraste nuevos 14 que etiquetan las células inmunes. Nuestro método es un enfoque basado en citometría de flujo y tiene varias ventajas.En primer lugar, todo el microambiente tumoral se puede muestrear; en el momento de análisis, todo el tumor subcutáneo y la periferia circundante se resecaron quirúrgicamente para su procesamiento. Esto elimina cualquier sesgo potencialmente muestreo dentro de un mismo tumor y le da un análisis más "global" del tumor en su conjunto. En segundo lugar, el uso de citometría de flujo multicolor para analizar los subconjuntos de leucocitos nos permite medir más específicamente el fenotipo de la infiltración de leucocitos. Dependiendo del número de colores utilizados, subconjuntos muy específicos pueden ser identificados. Esto es importante ya que hay varios subconjuntos de leucocitos dentro de un tipo de célula particular – o incluso en una clasificación general subtipo – que tienen funciones dispares que son potencialmente significativo en la determinación del destino del tumor. Por ejemplo, las células dendríticas plasmacitoides (PDC) han sido implicados en la inmunidad anti-tumor 15. Sin embargo, el subconjunto de CCR9 + PDC ha demostrado ser tolerogénico 16, y el desplazamiento de la balanza de un subconjunto de este tipo puede tener un impacto en el crecimiento del tumor.
Nuestro método es apropiado para la administración subcutánea u otros tumores que pueden ser resecados en bloque. En nuestras manos, los tumores se resecaron uniformemente en el momento de la eutanasia. Sin embargo, es concebible, como se ha hecho en algunos estudios, que un tumor subcutáneo podría ser completamente resecado con el cierre de la piel circundante en una cirugía de supervivencia 17, permitiendo así una evaluación adicional del animal. El análisis se realiza a continuación, en el tumor resecado. Por lo tanto, los resultados representan un único punto de tiempo en el desarrollo del tumor. Aunque esto permite una mirada detallada en el microambiente, también es una imagen estática de lo que es, sin duda, un proceso dinámico. Sin embargo, los leucocitos aislados (por ejemplo, a través de la separación magnética o gradiente de densidad), entonces se puede analizar por separado del epitelio y el estroma del tumor, o utilizado en otros ensayos funcionales, para definir aún más su fenotipo, como ha sido Previormente descrito 18. Este método, entonces, sería útil para cualquier investigadores interesados en la comprensión de la composición de los leucocitos en el microambiente del tumor en un punto de tiempo dado, ya sea en la configuración del curso natural de la enfermedad, o después de una perturbación terapéutico específico. Aunque no se ha hecho por nosotros, variaciones de este procedimiento podría también, potencialmente, ser utilizados para analizar partes específicas de un tumor en el aislamiento. Por ejemplo, dado el tamaño del tumor, la zona periférica (s) podría ser disecado de distancia desde el núcleo central, posiblemente necróticas del tumor para dar el investigador una visión más espacialmente segregado del microambiente del tumor.
En el floreciente campo de la inmunología tumoral, habrá sin duda un número exponencialmente creciente de estudios que evalúan nuevos agentes inmunomoduladores en modelos tumorales murinos. Varios informes han puesto de manifiesto las diferencias en función de los leucocitos específica dentro del tumor frente al periférico enambiente. Por ejemplo, Shafer-Weaver et al. Mostró en un modelo de ratón que las células específica de antígeno T efectoras CD8 +, mientras que activo en la periferia, se transformaron en células T supresoras CD8 +, una vez que la trata en el microambiente tumoral 19. Esto fue en parte debido a TGFß, pero otros factores tienden a estar involucrados también. Por lo tanto, la evaluación de subconjuntos de leucocitos – números y proporciones, así como el estado funcional – dentro del propio tumor dará una representación más precisa del efecto de una inmunomodulación en particular sobre el destino tumor.
Nuestra técnica permite el análisis detallado del tumor y proporciona al investigador la oportunidad de identificar más de cerca los cambios en las poblaciones de leucocitos que los enfoques anteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Realización de análisis detallado de la microambiente tumoral es crítico en la determinación de los mecanismos y efectos de inmunomodulación. Con la creciente presencia de inmunoterapia en el ámbito clínico en humanos, la comprensión del impacto de estos agentes en los leucocitos infiltrantes de tumores se está convirtiendo en indispensable en la definición de su mecanismo de acción. En los seres humanos, a menudo existen dificultades clínicas y / o logísticas para obtener y analizar el tejido tumoral para …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas-R01 CA169354 y R01-047822 de los Institutos Nacionales de Salud y un Premio al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos (BCE). RKP fue apoyado por el NIH T32 CA009287-30A1, un Premio de la ASCO Investigador Joven, California Breast Cancer Research Proyecto de Becas, y la Sociedad Americana del Cáncer Mentored Investigación Académico de subvención; BAZ fue apoyado por el NIH subvención AI079320. JM fue apoyado por becas del NIH T-32 becas de formación T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 y la Sociedad Americana del Cáncer beca post-doctoral PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
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