Abstract
Multiple sclerose is een inflammatoire aandoening van het centrale zenuwstelsel gekenmerkt door plaquevorming die verloren oligodendrocyten, myeline, axonen en neuronen. Remyelination is een endogene reparatie mechanisme waarbij nieuwe myeline na proliferatie, werving en differentiatie van oligodendrocyt voorloper cellen wordt geproduceerd in myeline-vormende oligodendrocyten, en is noodzakelijk om axonen te beschermen tegen verdere schade. Momenteel, alle therapieën voor de behandeling van multiple sclerose richten de afwijkende immune component van de ziekte, die inflammatoire aanvallen vermindert maar progressie tot irreversibele neurologische achteruitgang niet voorkomen. Het is daarom absoluut noodzakelijk dat-remyelination bevordering van strategieën worden ontwikkeld die progressie van de ziekte kan vertragen en misschien achteruit neurologische symptomen. Verschillende diermodellen van demyelinisatie bestaan, met inbegrip van experimentele auto-immune encefalomyelitis en curprizone; Er zijn limiwachtingen in het gebruik ervan voor het bestuderen remyelination. Een meer robuuste benadering is het centrale injectie van toxines in het centrale zenuwstelsel, waaronder het wasmiddel lysolecithin in het ruggenmerg witte stof van knaagdieren. In dit protocol, tonen we dat de chirurgische procedure betrokken injecteren lysolecithin in de ventrale witte stof muizen snel, kosteneffectief en vereist geen extra materiaal dan de commerciële. Deze procedure is niet alleen belangrijk voor het bestuderen van de normale gebeurtenissen betrokken bij de remyelinisatie proces, maar ook als een pre-klinisch hulpmiddel voor het screenen van kandidaat-remyelinisatie bevorderen therapeutica.
Introduction
Multiple sclerose (MS) is een chronische aandoening van het centrale zenuwstelsel (CZS), gekenmerkt door immuuncellen infiltratie en plaques die verloren myeline, oligodendrocyten, axonen en neuronen. De meeste patiënten hebben een ziekteverloop bestaande uit inflammatoire terugval gepaard met een groot aantal neurologische symptomen, gevolgd door perioden van remissie. Meer dan de helft van deze patiënten uiteindelijk de overgang naar een secundair progressieve fase zonder duidelijke terugval maar voortdurende neurologische achteruitgang. Aangenomen wordt dat deze progressieve verslechtering door axonale schade en verlies, gedeeltelijk bijgedragen door chronische demyelinisatie. Strategieën om verloren myeline te herstellen worden dus beschouwd als een veelbelovende behandeling benadering van progressie van de ziekte te vertragen en misschien achteruit neurologische symptomen.
Remyelination is een endogene reparatie reactie in het centraal zenuwstelsel, waarbij nieuwe myeline worden gegenereerd uit geworven oligodendrocyt voorloper cellen(OPC's) dat differentiëren in myeline-vormende oligodendrocyten. Remyelination is in diermodellen aangetoond zeer robuust 1-3, echter de efficiëntie afneemt met de leeftijd van 4 te zijn. Inderdaad, remyelinisatie bij mensen optreedt hoewel het onvolledig de meeste MS-patiënten 5. Alle momenteel beschikbare medicijnen voor MS hoofdzakelijk gericht op een afwijkende immunologische component van de ziekte, terwijl effectief verminderen terugval, niet duidelijk progressie van de ziekte vertragen. De volgende generatie van therapeutische strategieën voor de behandeling van MS zal de vooruitgang in immunomodulatie met de uitbreiding van de eigen remyelination integreren om zowel recidieven en progressie 6 te voorkomen.
Een methode bestuderen de- en remyelinisatie in het CZS omvat de directe injectie van het detergens lysofosfatidylcholine (lysolecithin) in het ruggenmerg witte stof 1,3,7. Deze werkwijze levert een goed gekarakteriseerd demyelinating letsel hoofdzakelijk bestaande uit macrofagen / microglia infiltratie en activering 8,9, reactieve astrogliose, verstoring van axonale homeostase / axonale letsels, en OPC-proliferatie en migratie 10. Het letsel voorspelbaar evolueert over de periode van een paar weken en is uiteindelijk in staat om volledig remyelinisatie. Deze werkwijze is bijzonder nuttig bij het bestuderen van de choreografie van gebeurtenissen betrokken bij de- en remyelinisatie geweest. Verder is aangenomen als een instrument voor pre-klinische testen van kandidaat-therapieën om de reparatie te versnellen na een demyeliniserende belediging.
Protocol
NB: De in deze procedure dieren werden verzorgd in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen. Ethiek werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Calgary.
1. Bereid Spuit voor Injectie
- Los lysolecithine een 1% oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4) en bewaar bij -20 ° C in kleine porties (75 pl). Dooi een flacon tot kamertemperatuur.
OPMERKING: als lysolecithin is onopgelost, ultrasone trillingen de buis in een ultrasoon reiniger (40 kHz) gedurende ongeveer 30 minuten tot een gelijkmatige oplossing te vormen. - Omgaan met de pre-getrokken glazen capillaire met uiterste zorg te voorkomen dat schade aan de delicate tip. Moer van een 10 pl injectie spuit en haal op het platte uiteinde van de capillair, gevolgd door 2 ferrules, zodat de parende einden van de ferrules richten en de capillaire strak in de konische klemring (figuur 1). Spoel de spuit met isopropyl alcohol en verwijder de zuiger. Eenmaal droog, schroef de naald assemblage hand vast op het injecteren spuit.
- Bevestig de metalen hub naald naar de priming spuit. Pierce een rubberen schijf met de naald en schuif deze naar beneden naar de basis. Vul de priming spuit met lysolecithine. Druk zachtjes de priming spuit totdat vloeistof zichtbaar is op het puntje van de naald. Hierdoor luchtbellen niet worden ingebracht in het injecteren spuit.
- Steek de metalen hub naald van de priming spuit in het injecteren spuit. Het maken van een stevige afdichting met de rubberen schijf, langzaam druk de priming spuit totdat de capillaire vult aan het uiteinde met de oplossing. Verwijder voorzichtig de priming spuit terwijl tegelijkertijd indrukken om de loop van het injecteren van injectiespuit te vullen zonder dat er luchtbellen. Breng de zuiger in de spuit injecterende en waarborgen oplossing stroomt uit de punt van de capillair als de plunjer zachtjes ingedrukt.
OPMERKING: Als er luchtbellen zichtbaar zijn in de dopIllary of injecteren spuit, moet de spuit voorbereiding worden herhaald vanaf het begin. Continue fluïdum in de injecteerapparaat kritisch nauwkeurige injectievolume waarborgen. - Bevestig de ingevulde injecteren spuit aan de arm van een stereotactische micromanipulator. Dit voltooide inrichting kunnen tot 15-20 dieren injecteren voordat ze moeten worden bijgevuld.
- Gooi de resterende lysolecithin van de priming spuit. In te trekken en druk isopropylalcohol meerdere malen, en maak de metalen hub naald. Wacht enkele uren voor de resterende isopropylalcohol in de priming spuit te laten verdampen alvorens opnieuw te vullen.
2. Bereid Animal voor chirurgische ingreep
OPMERKING: Deze procedure is beschreven voor vrouwelijke C57BL / 6 muizen, 8-10 weken leeftijd.
- Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van ketamine (200 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) of per institutionele dierenzorg voorschriften. Plan voor dedier onder narcose ongeveer 1 uur indien injecteerbare verdoving.
- Test dat het dier diep wordt verdoofd door stevig knijpen de voet. Een goed verdoofd dier zal niet reageren op de knel.
- Met tondeuse, scheren 2-3 cm2 gebied aan de dorsale zijde van het dier dichtbij de oren. Wees voorzichtig niet om de oren te beschadigen.
- Veeg het gebied schoon met 70% ethanol toegepast op een gaasje. Zorg ervoor dat alle geknipt haar is verwijderd uit het gebied. Ontsmet het gebied met jodium.
- Vaseline voor de ogen droging gedurende de procedure te voorkomen.
- Houd het dier in een verwarmde recovery kamer tot klaar om de procedure te starten.
3. Voer de chirurgische ingreep
OPMERKING: Zorg voor voldoende aseptische techniek voor alle stappen van de procedure. Dit geldt ook voor het juiste gebruik van handschoenen, haarnetjes, maskers, en gordijnen. Alle instrumenten moeten worden gesteriliseerd voordat ze in contact met het dier.
- Verplaats het dier naar een stereotactische frame, dorsale kant naar boven, verheven op het midden gedeelte door gevouwen papieren handdoeken om de kromming van de wervelkolom te overdrijven. Bevestig de armen en staart met chirurgische tape en zet het hoofd met een tand klem. Stabiliserende oor bars zijn niet nodig voor deze procedure.
- Gebruik een scalpel een 3 cm middellijn incisie vanaf net onder de oren en snijden in de caudale richting.
- Zoek de kloof tussen de 2 grote vet- structuren en gebruik fijne tang in elke hand om deze uit elkaar te trekken. Verspreid oprolmechanismen het chirurgisch veld te openen.
- Onder een chirurgische microscoop, zoekt de prominente uitgroei proces van de T2 wervel (Let op: deze functie is kenmerkend voor de C57BL / 6 muis stam). Voer een stompe dissectie met gesloten voorjaar een schaar door de superpositie spieren beter te visualiseren T2. Met behulp van de tang, voelen voor de harde oppervlakken van T3 en T4 om de juiste anatomische locatie te bevestigen.
- Met behulp van de lente schaar, maken ondiepe laterale bezuinigingen (2-3 mm diep) van het bindweefsel tussen T3 en T4. Vanwege de natuurlijke afstand tussen wervels in de thoracale deel van de wervelkolom muis, een laminectomie niet nodig om het ruggenmerg te onthullen. Wees bewust dat te diep een cut zal doorboren en schade aan het snoer.
OPMERKING: Een kleine mate van bloeden is gebruikelijk tijdens deze stap. Als dit gebeurt, houdt een spons speer in het gebied tot de bloeding afneemt (30-60 sec). - Visualiseer het ruggenmerg. Het zal worden bedekt met een dikke laag zichtbaar dura indien meningeale laag nog niet werd onderbroken terwijl het blootstellen van het snoer. Een prominente bloedvat loopt caudale / rostral door de geschatte middellijn van het ruggenmerg.
LET OP: Deze vaatstelsel mag niet worden gebruikt als een mijlpaal voor de middellijn. In plaats daarvan moet voldoende verlichting van de grijs-witte stof grenzen aan weerszijden van de dorsale kolom te onthullen, en deze moeten worden gebruikt voor het schatten van de middellijn. - Als de duraintact blijft, maken zachte laterale schraapt met een 32 G metalen naald totdat het wordt gewist. Het doel is om de dura verwijderen terwijl niet het snijden van de overige onderliggende hersenvliezen, die niet zo dik en moeilijker te zien.
OPMERKING: introductie van cerebrospinale vloeistof geeft een schending van de arachnoid en hoewel dit kan optreden zonder mechanische schade aan het weefsel, zou de geaccumuleerde cerebrospinale vloeistof worden verwijderd met een spons speer beter visualiseren het oppervlak van het koord. - Verplaats de injectie spuit in plaats langzaam zakken totdat het uiteinde van de capillair nauwelijks raakt het ruggenmerg direct lateraal van beide zijden van de middellijn. Vergrendelen van de arm op zijn plaats.
- Gebruik de gesorteerde metingen van de Z-richting stereotactische arm een uitgangspositie meting. Uit deze lezing aftrekken 1.3 mm. Gebruik maken van een snelle en ondiepe neerwaartse beweging om het weefsel te doorboren en dan kantel de capillaire totdat de nieuwe meting is bereikt. Facultatief: desgewenst,laesies in de dorsale kolom kan worden geproduceerd door dezelfde piercing motie bij de middellijn en een diepte van 0,3 mm (zie bespreking voor meer informatie).
Opmerking: Deze waarden zijn specifiek voor het injecteren van T3 en T4. Indien kiezen voor de injectie voeren op welke plaats in het ruggenmerg, moet deze waarde worden afgeleid van elk beschikbaar muizenhersenen atlas. - Gebruik de micromanipulator om lysolecithine druk in de ventrale ruggenmerg witte stof. Voeg 1 rotatie van de micromanipulator elke 5 seconden gedurende 2 min, resulterend in een uiteindelijk volume van 0,5 pl. Laat de capillaire in de plaats voor 2 extra minuten om terugstromen van de oplossing te voorkomen, en dan verwijder voorzichtig het capillair.
- Maak een enkele hechting in de spier / vetweefsel overlappen de wervelkolom. Gebruik een niet-onderbroken hechting aan de huid te sluiten. Breng meer jodium aan de incisie.
- Plaats het dier in een verwarmde recovery kamer totdat het zich herstelt, dan terug naar zijn kooi. Solliciteer analgetica post-operatief als per institutionele dierverzorging regelgeving. Extra postoperatieve zorg is meestal niet nodig omdat de dieren volledig ambulant en zichzelf kan voeden en drinken zodra herstel van anesthesie.
- Herhaal de procedure voor de resterende dieren.
OPMERKING: Bij vaardigheid, de bediening kan worden in 10-15 minuten per dier aangevuld, vooral met behulp van een tweede persoon binden hechtingen. Hetzelfde glas capillair kan voor ongeveer 15-20 operaties voor de tip bot wordt en moet worden vervangen. Controle operaties kunnen identiek worden uitgevoerd zoals beschreven, met een injectie van PBS in het ruggenmerg in plaats van lysolecithine. We raden niet aan het schoonmaken van de haarvaten voor toekomstig gebruik.
4. Tissue verwerking en analyse
- Offer de dieren een intraperitoneale overdosis van ketamine (500 mg / kg) en xylazine (25 mg / kg) op gewenste tijdstippen. Laesies meestal evolueren in de follvanwege manier: 1-3 dagen, actieve demyelinisatie; 3-7 dagen, OPC aanwerving; 7-10 dagen, oligodendrocyte differentiatie; 10-21 dagen, actieve remyelination 2,10,11.
- Om weefsel voorbereiding histologie, eerst een transcardial perfusie 12 voeren met 20 ml RT PBS gevolgd door 20 ml ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS. Voor de bereiding van hars ingebed weefsel voor semi- of ultradunne snijden, zie stap 4.9.
- Verwijder het ruggenmerg met gebogen been schaar door elk wervels vanaf het cervicale uiteinde van de wervelkolom en omlaag werkt naar de lagere thoracale af te scheren. Bevestig het ruggenmerg O / N in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C. Schakel de koorden 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende ten minste 72 uur.
- Identificeer de injectieplaats als afwijkingen op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg. Snijd een 3 mm stukje weefsel (met de plaats van injectie in het midden) en lijn de stukken in cryomolds met optimale snijtemperatuur (oktober) compound. Hang de onderkant van de cryomolds in een gekoelde mengsel van 2-methylbutaan en droog ijs tot het oktober is volledig bevroren. Bewaren bij -80 ° C tot klaar om sectie.
- Sectie het ruggenmerg op een cryostaat op een breedte van 20 urn op objectglaasjes en aan de lucht drogen O / N alvorens de objectglaasjes bij -20 ° C.
- Detecteren laesie locatie en grootte met behulp van een eriochroomcomplex cyanine- histologische vlek van myeline 13. Voer alle stappen bij RT. Lucht drogen dia's voor 30 min. Plaats de glaasjes in klaringsmiddel gedurende 1 min gevolgd door rehydratatie in gegradeerde ethanol-oplossingen (100%, 95%, 90%, 70%, 50% water) gedurende 1 min elk.
- Plaats de glaasjes in eriochroomcomplex cyanine oplossing gedurende 15 min, gevolgd door 1 min wassen met water. Onderscheid in 0,5% ammoniumhydroxide gedurende 10 sec, gevolgd door 1 min wassen met water. Uitdrogen in ethanolreeks oplossingen (omgekeerde volgorde zoals hierboven beschreven) gedurende 1 minuut per stuk, dekglaasje met montage media en beeld op een fel-veld microscope.
- Gebruik immunohistochemie om axonen en myeline visualiseren. Lucht drogen dia's voor 30 min. Dehydrateer met gegradeerde ethanol (water, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) gedurende 2 min elk bij kamertemperatuur, daarna omgekeerde volgorde naar water. Deze stap resulteert in hogere resolutie individuele myeline ringen 14.
- Blokkeer niet-specifieke antilichaam interacties met 10% geit serum en 0,25% Triton X-100 in PBS gedurende 60 min bij kamertemperatuur. Verdun primaire antilichamen (muis anti-SMI312 1: 2000, konijn anti-MBP 1: 1000) in PBS en incubeer op objectglaasjes O / N bij 4 ° C.
- Was 5 keer gedurende 5 min met PBS bij kamertemperatuur. Verdun secundaire antilichamen (Alexa 488 anti-konijn 1: 500, Alexa 546 anti-muis 1: 500) in PBS en incubeer op objectglaasjes gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Was 5 keer gedurende 5 min met PBS bij kamertemperatuur. Mount glijdt met dekglaasjes behulp gelvatol en beeld op een fluorescentiemicroscoop.
- Gebruik immunohistochemie cellen van de oligodendrocyt lijn visualiseren. Volg de procedure voor step 4.7, met weglating van de uitdroging / rehydratie stap, en het gebruik van 10% paard serum in plaats van geitserum. Gebruik de volgende primaire antilichaam verdunningen: geit anti-PDGFRα 1: 100, muis anti-CC1 1: 200, konijn anti-Olig2 1: 200. Gebruik de volgende secundaire antilichaam verdunningen: Alexa 488 anti-geit 1: 500, Alexa 594 anti-muis 1: 500, Alexa 647 anti-konijn 1: 500.
- Om weefsel bereiden semi- of ultradunne snijden eerst een transcardial perfusie 12 voeren met 20 ml RT PBS gevolgd door 20 ml ijskoude 4% paraformaldehyde / 1% glutaaraldehyde in PBS. Verwijder ruggenmerg zoals beschreven in stap 4.3. Fix O / N in 4% paraformaldehyde / 1% glutaaraldehyde in PBS bij 4 ° C.
- Identificeer de injectieplaats zoals beschreven in stap 4.4. Snij een 1 mm stukje weefsel dat de injectieplaats. Extra 1 mm blokken aan weerszijden van de laesie kan ook worden bereid indien gewenst.
- In een zuurkast, voeg 10 maal volume 1% osmiumtetroxide / 1,5% kaliumferrocyanide om elk blok op het ijs60 min.
OPMERKING: osmiumtetroxide is een zeer giftige stof en moeten met uiterste zorg worden behandeld. Alle materialen in contact met osmiumtetroxide moeten maïsolie (tweemaal volume osmiumtetroxide oplossing) worden geplaatst voor neutralisatie. - Was koorden 3 maal met 0,2 M cacodylaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur Werp in maïsolie. Dehydrateer met gegradeerde ethanol-oplossingen (water, 50%, 70%, 90%, 2 maal met 95%, 2 maal met 100%, 2 maal met propyleenoxide) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Insluiten snoeren in hars volgens de instructies van de fabrikant.
- Snij blokken op een ultramicrotoom en monteer secties op waterdruppels op objectglaasjes. Plaats de glaasjes op een hete plaat (ongeveer 50 ° C) tot droog.
- Visualiseer myeline door toevoeging van enkele druppels 1% toluidine blauw / 2% borax oplossing op de objectglaasjes gedurende 10-15 seconden bij 50 ° C. Spoelen met water, droog en dekglaasje met montage media. Afbeelding delen op een heldere-veld microscoop.
Representative Results
Focal injectie van lysolecithine in de ventrale witte stof produceert een discrete demyeliniserende laesie die detecteerbaar is over een afstand van ongeveer 3 mm (figuur 2). Immunohistochemische kleuring van de laesie kern voor myeline (MBP) en axonen (SMI312) blijkt axonen die zijn ontdaan van myeline 7 dagen (figuur 3). Bij 14 dagen worden veel axonen omgeven door MBP-positieve ringen, waardoor het optreden van remyelinisatie suggereert. Kleuring voor cellen van de oligodendrocyten afstamming (PDGFRα, Olig2, CC1), er een significante toename van zowel het totale aantal cellen na 14 dagen in vergelijking met 7 dagen, evenals de verdeling van rijpe oligodendrocyten opzichte OPC (figuur 4) . Consistent met deze bevinding semithin secties gekleurd met toluidine blauw tonen de aanwezigheid van dunne myeline 14 dagen die zelden worden gedetecteerd 7 dagen (Figuur 5), wat aangeeft dat deze i remyelinatednternodes.
De procedure is zeer reproduceerbaar tussen dieren. Variatie treedt op wanneer zware ademhaling verandert de stationaire positie van de capillair-dit is meestal niet een probleem met adequate sedatie. Schade aan axonen lijkt miniem, behalve in het centrum van de laesie, die is beschreven sinds de vroegste gebruik van het model 1. Wij geloven dat dit mechanische verwonding door de glazen capillair, zoals het ook waarneembaar in PBS geïnjecteerde controles. Niettemin variabiliteit vaak klein, en hebben wij en anderen met een soortgelijke procedure verschillen tussen de experimentele condities met slechts 4 dieren per groep 15 gedetecteerd.
Figuur 1. Montage van de injectie spuit. (A) De moer van het injecteren spuit geregen op t Hij platte uiteinde van de glazen capillair, gevolgd door 2 ferrules dat hun paring eindigt interlock. Zodra de capillaire stevig is knus in de conische ferrule, wordt het geheel geschroefd hand vast op het uiteinde van de spuit te injecteren. (B) fragment het centrum van een rubberen schijf met de metalen hub naald bevestigd aan de priming spuit en schuif deze naar beneden te de basis. (C) Trek lysolecithineoplossing in de priming spuit. (D) druk voorzichtig priming spuit totdat de eerste druppel lysolecithine zichtbaar bij de punt van de naald. (E) Plaats de priming spuit in de loop van de injecterende spuit, waardoor een stevige afdichting met de rubberen schijf. Druk de oplossing voorzichtig tot deze loopt naar het einde van het capillair. Trekken voorzichtig de priming spuit met behoud van de druk op de zuiger om de metalen hub naald te verwijderen zonder dat er luchtbellen in de spuit te injecteren.upload / 52.679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger lysolecithine laesie gekleurd met eriochroomcomplex cyanine-. Serial secties (afstand van 400 pm van elkaar) van een karakteristiek lysolecithine laesie na 14 dagen gekleurd met eriochroomcomplex cyanine- om myeline (blauw) te visualiseren. Merk op dat demyelinatie is beperkt tot de ventrale witte stof en dat de laesie overspant ongeveer 3 mm in de rostrale / caudaal. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. axonen en myeline inde lysolecithine model. (A) A sham (PBS) geïnjecteerd ruggenmerg 7 dagen blijkt gezond axonen die zijn omgeven door myeline ringen. (B) A lysolecithine letsel na 7 dagen toont ontdaan axonen en afgebroken myeline. (C) 14 dagen, een percentage axonen (voorbeelden aangegeven met witte pijlpunten) geassocieerd zijn met de terugkeer van myeline ringen. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Oligodendrocyte afkomstcellen in de lysolecithine model. (A, C) na 7 dagen, is er een grotere weergave van PDGFRα + OPC (witte staven) ten opzichte CC1 + oligodendrocyten (magenta staven); de nummers binnen de balken geven percentages. Olig2 werd gepeild naarbevestigen kleuring van oligodendrocyt afkomstcellen. (B, C) bij 14 dagen, is er een aanzienlijke toename van het aantal oligodendrocyten afkomstcellen tegenover 7 dagen (p <0,05, tweezijdige t-test, n = 4 per groep ). Er is ook een aanzienlijke toename van de verspreiding van oligodendrocyten te OPC 14 dagen ten opzichte van 7 dagen (p <0,0001, Fisher's exact test). Schaal bar = 10 micrometer. Elk veld wordt vastgelegd met een originele vergroting van 60X. Waarden zijn gemiddelden ± SD. * Betekent p <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Remyelinisatie in de lysolecithine model. (A) Een dwarsdoorsnede toluïdine blauw gekleurde semithin gedeelte van de ventrale witte stof in een healthy muis toont axonen over een breed scala van kaliber met respectieve myeline dikte. (B) op 7 dagen, een gebrek aan myeline is grenzend waargenomen om een onaangetast gebied (rechtsonder). (C) Op 14 dagen, in dunne gemyeliniseerde scheden ( voorbeelden aangeduid met rode pijlpunten) lijken gehele laesie indicatief remyelinated segmenten. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Een aantal diermodellen zijn ontwikkeld om MS meeste herkenbaar experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) model te bestuderen. In EAE, knaagdieren worden geïmmuniseerd tegen een fragment van myeline peptide ondergaan inflammatoire laesie ontwikkeling manifesteert oplopend verlamming. Hoewel dit model bruikbaar voor pre-klinische testen van immunomodulerende MS drugs is geweest, het is niet ideaal voor het bestuderen van remyelination om drie belangrijke redenen: Ten eerste, de locatie van inflammatoire laesies is enigszins willekeurig, en het lokaliseren van letsels bij het verwerken van weefsel voor semi- of ultradunne secties kan een uitdaging zijn. De tweede is dat remyelination optreedt over een bepaalde tijd natuurlijk, en de exacte leeftijd van een enkele EAE laesie kan niet gekend worden, zonder voortdurende niet-invasieve magnetische resonantie beeldvorming. De derde is dat remyelinisatie is een natuurlijk verschijnsel bij knaagdieren en bewijs van remyelinisatie na behandeling met geneesmiddelen in EAE kan een primair resultaat van het geneesmiddel niet, maar inStead een secundaire fenomeen van het verminderen van ontstekingen.
Een andere gebruikelijke werkwijze voor het produceren demyelinatie wordt bereikt door de koper chelator cuprizone in het dieet. Dit resulteert in wijdverspreide demyelinisatie, met name in het corpus callosum. Er zijn beperkingen in het bestuderen van de corpus callosum als gebied van remyelinisatie om de volgende redenen: axon diameter (en dus myeline dikte) kleiner dan andere CNS-regio's, en derhalve dun remyelinated omhulsels kunnen onderscheiden van die die nooit waren gedemyeliniseerde zijn. Ten tweede omdat de muis corpus callosum bevat> 70% gemyeliniseerde axonen 16, kan het onduidelijk is of een remyelinated segment waar herstel van beschadigde myeline of de novo synthese van myeline in de volwassene die gewoonlijk voorkomt 17 zijn.
Het is onze overtuiging dat het beste model voor het bestuderen van remyelination is de directe injectie van giftige stoffen, ofwel lysolecithine, ethidiumbromide, of anderen, in de staartplooi cerebrale steeltjes 18 of het ruggenmerg witte stof. De vorige locatie wordt bereikt door nauwkeurige 3-dimensie stereotactische injectie, en is beperkt tot grotere knaagdieren (ratten) vanwege de kleine omvang van de cerebellaire steeltjes. Dit is exclusief de uitgebreide bron van transgene muizen in het bestuderen van de- en remyelinisatie. Het ruggenmerg bevat echter veel grote witte stof traktaten die gemakkelijk toegankelijk zijn operatief. Ruimten tussen wervels in de rostrale thoracale segment maakt blootstelling van het ruggenmerg zonder laminectomie, wat een noodzakelijke stap in caudale thoracale chirurgische procedures. Een voordeel van die specifiek gericht zijn op de ventrale witte stof is dat de axonen zijn gelijkmatig groter dan de dorsale witte stof, waardoor kwantificering van remyelination een minder dubbelzinnige taak-vergelijkbaar met de uitdagingen in verband met het corpus callosum. Bovendien, de ventrale witte stof vormt een veel grotere tArget moet injecteren; enkele honderden microns lateraal in de dorsale regio zou de capillaire plaatsen buiten de kolom, terwijl dezelfde afwijking ventraal nog zouden produceren een prominente demyeliniserende laesie. Sommige protocollen injecteren lysolecithin zowel in de dorsale en ventrale kolommen van hetzelfde dier 19. Dit kan zowel de waarschijnlijkheid van een goede capillaire plaatsing en het aantal meetbare laesies bij minder dieren te verhogen. Terwijl de huidige gepresenteerde gegevens is 8-10 weken oude dieren op het moment van de operatie, hebben we ook succes gehad met dezelfde procedure op 8-10 maanden oude muizen, waar remyelination wordt beschreven en zijn beduidend langzamer 4.
Kwantificering van remyelination is geen triviale onderneming. Een centrale dogma stelt dat remyelinated segmenten zijn korter en dunner gemiddeld dan hun gezonde collega's, en dus g-verhouding berekeningen (axon diameter gedeeld door axon + myeline diameter) van de cross-sectionele semi- or ultradunne coupes zijn standaard procedure geworden. Het is echter bekend dat remyelinated segmenten dikker tijd 2 en een recent onderzoek waarbij een transgene reporter van remyelinisatie oligodendrocyten verwerken veel internodien uiteindelijk onderscheiden van controle 20 worden. Kwantificeren van het aantal rijpe oligodendrocyten in de laesie indirecte wijze te herstellen te meten, oligodendrocyten zijn in staat om een groot aantal internodien, en een aanzienlijk deel van remyelinisatie, afhankelijk van het gebruikte model, kan van Schwann-cellen 3. Natuurlijk, zoals remyelinisatie is verbonden met het herstel van sprongsgewijze geleiding 21, het ultieme criterium van herstellen zou functioneel herstel van neurologische tekorten zijn. Hoewel remyelinisatie is gekoppeld aan herstel van de functie in sommige soorten 22,23, maar het is een standaard procedure muizen lysolecithine studies worden. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan openlijke OBSERVkunnen tekorten van beide dorsale of ventrale laesies, vergeleken met meer robuuste demyelinisatie modellen zoals EAE en zelfs cuprizone. Wij zijn van mening dat functionele tekorten als gevolg van lysolecithine injectie, en de daaropvolgende herstel met remyelination, wordt alleen waarneembaar zijn met behulp van gevoelige testen van fijne sensomotorische functioneren.
Een PubMed zoeken van "remyelination" naast een van de diermodellen hierboven vermeld, zij het een bruuske methodologische aanpak, blijkt minder zoeken treffers voor lysolecithine (109) in vergelijking met EAE (188) en cuprizone (197). Als onze stelling dat lysolecithine demyelinisatie is de superieure benadering voor het bestuderen van remyelination, waarom is het de minst besproken? Misschien een vrees voor het gebruik van deze werkwijze vloeit voort uit een geloof technische moeilijkheden bij het uitvoeren van de chirurgische ingreep. In werkelijkheid is deze procedure is snel, kosteneffectief en is niet moeilijker dan routine weefseldissectie, waarbij dat alle materialen zijn commer-cieel beschikbaar. Het is onze hoop dat dit protocol handig voor degenen die wensen om deze krachtige model toe te voegen aan hun repertoire voor het bestuderen van de spannende en groeiende sector van myelineherstel bewijst.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R.
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
