Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l'efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l'aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l'analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test anti-droga. 3 Purtroppo, saggi cellulari monostrato spesso non riescono a prevedere l'efficacia di composti in vivo, rendendo lo sviluppo di farmaci e la scoperta di un processo estremamente costoso. 4,5 Nonostante investimento significativo e lo sforzo da aziende farmaceutiche e unità accademiche, solo ~ 1% di anti-cancro sono stati approvati i farmaci negli studi clinicidalla FDA negli ultimi due decenni. 6 Disparità tra culture 2D e l'ambiente 3D complesso di cellule tumorali in vivo è una grave lacuna di sistemi di coltura monostrato. 7 Pertanto, lo screening di composti candidati contro le cellule tumorali in un ambiente che assomiglia più da vicino l'ambiente tumore 3D potrebbe accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci chemioterapici. 8
Sferoidi di cellule di cancro presentano un rilevante modello di tumore 3D in vitro. 9,10 Spheroids sono gruppi compatti che si formano attraverso l'assemblaggio spontanea o indotta delle cellule tumorali su superfici non aderenti o in sospensione utilizzando tecniche come pallone filatore, overlay liquido, micro- microfabbricazione . ben array, microfluidica, e gocce appesi 11-16 Spheroids imitano le caratteristiche principali di tumori solidi, tra cui la geometria e il trasporto limitata di ossigeno, sostanze nutritive, e composti di droga nella zona centrale; di conseguenza, hanno più da vicino rigenerano respon drogase di tumori solidi rispetto a colture monostrato. 17-19 Nonostante questo notevole vantaggio, sferoidi non sono comunemente usate per lo screening di composti chimici contro le cellule tumorali. Difficoltà di produrre sferoidi uniformi dimensioni in un ambiente standard elevato rendimento che è compatibile con la robotica disponibili in commercio e strumenti di screening / immagini impedisce l'incorporazione della cultura sferoide in pipeline di sviluppo di farmaci. Anche se i materiali personalizzati e piastre hanno recentemente resi disponibili in commercio per rispondere a questa esigenza, le considerazioni sui costi scoraggiare il loro uso diffuso.
Due importanti tecniche con la capacità di produrre sferoidi dimensioni consistenti in un throughput elevato utilizzare una nuova piattaforma goccia pendente e microfabbricati micro-pozzetti. 13,16,20 Tuttavia, entrambi gli approcci richiedono piatti e dispositivi che sono costosi da produrre e scomodo per gli utenti endpoint speciali in centri di ricerca di base e le industrie farmaceutiche, dove la più grande efforti per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro sono fatti. Nonostante alcuni miglioramenti nella stabilità di gocce di cellule contenenti un recente disegno di appendere piastre goccia, solo ogni foro della piastra è ancora usato durante la coltura per evitare la diffusione / fusione di gocce. 16 Ciò riduce significativamente il throughput sperimentale. Inoltre e rinnovamento della droga è difficile con manuale o robotizzato pipettaggio e sferoidi devono essere trasferiti in una piastra standard per l'analisi biochimica, perché questa configurazione targa non è facilmente compatibile con gli apparecchi tradizionali, come lettori di piastre. 21 micro-pozzetti fabbricati usando litografia soft anche consentire dimensione controllata produzione sferoide. 13,20 Tuttavia, l'incompatibilità di questa piattaforma con strumenti di pipettaggio standard di trattamento impedisce di sferoidi individuali con composti farmacologici / concentrazioni diverse, esponendo tutti sferoidi a una sola condizione di trattamento. Così, questo metodo non è appropriato per altalo screening composti rendimento che richiede il test simultaneo di più composti / concentrazioni.
Per superare questi ostacoli, è stata sviluppata una nuova tecnica per la produzione ad alta velocità di costantemente dimensioni sferoidi di cellule di cancro in piastre a 96 pozzetti standard. 22,23 L'approccio si basa su un sistema polimerico acquoso bifase (ATPS) con polietilene glicole ( PEG) e destrano (DEX) polimeri in fase di formatura. 24 ATPSs sono state recentemente utilizzato in una varietà di applicazioni biologiche romanzo cellulari per consentire micropatterning cellulare e localizzata consegna dei reagenti biologici alle cellule in mezzi acquosi altamente. 25-32 Per formare un sferoide, le cellule tumorali sono mescolati con la fase acquosa DEX e un calo sub-microlitri della sospensione risultante viene pipettato in una immersione soluzione fase PEG acquosa contenente bene. La goccia rimane immiscibile dalla fase di immersione e cellule limita a facilitare la formazione di uno sferoide. Diavolettoortantly, la fase di immersione molto acquosa fornisce sostanze nutritive alle cellule della sferoide e minimizza il problema ben noto dei media evaporazione comune ad alcuni altri test che causano i cambiamenti nei mezzi osmolalità e le fluttuazioni delle concentrazioni di droga. Questa tecnica permette la produzione sferoide e trattamento farmacologico solo utilizzando reagenti disponibili in commercio e strumenti di dispensazione in piastre da 96 pozzetti standard. È importante sottolineare che l'analisi delle risposte cellulari di sferoidi viene eseguita nella stessa piastra utilizzando saggi biochimici standard e lettori di piastre. La facilità di lavorare con ATPS e adattabilità del approccio alla gestione dei liquidi robotizzato fa generazione ad alto rendimento sia mono-cultura e di co-coltura sferoidi una tecnica di laboratorio semplice. Questo nuovo approccio sarà un importante passo avanti verso l'integrazione di sferoidi di cellule di cancro nei processi di sviluppo di farmaci e di scoperta con una migliore velocità di test e di costo-efficacia (un numero crescente di composti e Redu testaticonsumo di reagente ced) e l'efficienza (riduzione hands-on tempo).
Un protocollo dettagliato per la produzione robotizzata di sferoidi di cellule di cancro in piastre da 96 pozzetti utilizzando l'approccio ATPS è descritto di seguito. Inoltre, i dettagli di trattamento farmacologico di sferoidi conseguenti e analisi a valle delle risposte cellulari utilizzando un test biochimico commerciale sono presentati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l'efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L'uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
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