İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
Hücre bazlı analizler geliştirme ve yeni bir anti-kanser ilaçların bulunması için önemli bir araç sağlar. 1,2 Tarihsel, kanser hücrelerinin tek tabakalı kültürleri kanser hücrelerinin belirli türlerine karşı aday bileşiklerinin etkinliğini araştırmak üzere istihdam edilmiştir. standart kültür plakaları içinde tek tabakalı kültürler bakım kolaylığı, reaktifler ilave edildikten ticari robotik araçlar ile standart levha uyumluluğu ve kimyasal bileşikler hücresel tepkilerin alt analizi için tarama ekipmanı ile 2D Kültürlerin çekici bir araç kılan en önemli yararlar uyuşturucu testi için. 3 yazık ki, tek tabakalı hücre deneyleri genellikle ilaç geliştirme ve keşif son derece pahalı verme süreci, in vivo bileşiklerin etkinliğini tahmin etmek başarısız. 4,5 ilaç şirketleri ve akademik birimler, sadece ~% 1 önemli yatırım ve çaba rağmen Kanser karşıtı klinik çalışmalarda ilaç onaylanmıştırSon yirmi yıl içinde FDA tarafından. 2B kültürleri ve in vivo olarak kanser hücrelerinin, karmaşık 3 ortamı arasında 6 eşitsizlik tek tabakalı kültürü sistemlerinin önemli bir eksikliktir. 7 Bu nedenle, ortamda tümör hücrelerine karşı Aday bileşiklerin tarama daha yakından benzemektedir 3D tümör çevre roman kemoterapi ilaçlarının gelişimini hızlandırmak olabilir. 8
Kanser hücresi sferoidler, in vitro olarak ilgili bir 3D tümör modeli sunar. 9,10 olan sferoitler hususiyetlerini yapışmayan yüzeylerde ya da dönen bir şişede, sıvı kaplama, mikrofabrike mikro gibi teknikler kullanılarak süspansiyon içinde kanser hücrelerinin kendiliğinden ya da neden olduğu bir montaj ile oluşturan yoğun kümeleri . diziler, mikroakışkanlar ve asılı damla de 11-16 sferoitler geometri ve merkezi bölgeye oksijen, besin ve ilaç bileşiklerinin sınırlı ulaşım dahil olmak üzere katı tümörlerin temel özelliklerini taklit; dolayısıyla, onlar daha yakından uyuşturucu yanıtlayanların yenidentek tabakalı kültürleri ile karşılaştırıldığında katı tümörlerin bir bileşiğe dönüştürülebilir. Bu belirgin yarar rağmen 17-19 sferoidler rutin kanser hücrelerine karşı kimyasal bileşiklerin taranması için kullanılmamaktadır. Piyasada mevcut robotik ve tarama / görüntüleme araçları ile uyumlu bir standart yüksek kapasiteli ortamda üniforma ölçekli spheroidler üreten Zorluk ilaç geliştirme boru hattına sfero kültürünün birleşmesini engellemektedir. Özel malzemeler ve plakalar son zamanlarda bu ihtiyacı gidermek için piyasada mevcut hale gelmiştir rağmen, maliyet düşünceler onların yaygın kullanımını engellemek.
Yeni asılı damla platformu ve mikrofabrike mikro-kuyuları kullanmak yüksek verimlilik tutarlı ölçekli spheroidler üretme yeteneği ile iki önemli teknikler. 13,16,20 Ancak, her iki yaklaşım özel plakaları ve imal pahalı ve uç nokta kullanıcılar için sakıncalı olan cihazlar gerektirir temel araştırma merkezleri ve ilaç sanayi, en büyük ef içindeyeni anti-kanser ilaç keşfi için kale yapılır. Damla plakaları asılı bir son tasarımı ile hücre içeren damla istikrar bazı iyileşmelere rağmen, plakanın sadece her delik hala damla yayılması / birleştirilmesi önlemek için kültür sırasında kullanılır. 16 Bu önemli ölçüde deneysel verim azalır. İlaç ilave ve yenileme kılavuzuna veya robotik pipetle zor ve bu plaka konfigürasyonu gibi plaka okuyucu gibi geleneksel tarama donanımları ile kolayca uyumlu olmadığı için sferoidler biyokimyasal analiz için standart bir plaka aktarılır gerekir. 21 Mikro-kuyuları da yumuşak litografi kullanarak imal Kontrollü boyutu sfero üretimine izin. 13,20 Ancak, standart pipet araçları ile bu platformun uyumsuzluk tek bir tedavi durumu tüm sferoitleri açığa farklı ilaç bileşikleri / konsantrasyonları ile bireysel küremsi tedavi önler. Bu nedenle, bu yöntem için uygun değildirçok sayıda bileşik / konsantrasyonları aynı anda test gerektirir akış bileşik taraması.
Bu engellerin üstesinden gelmek için, standart 96 oyuklu plakalar içinde sürekli boyutlu kanser hücresi sferoitlerin yüksek verimli üretimi için yeni bir teknik geliştirilmiştir. 22,23 yaklaşım polietilen glikol ile bir polimer sulu bir, iki fazlı bir sistem (ATPS) (dayanır faz oluşturucu polimerler PEG) ve dekstran (Dex). 24 ATPSs son hücre micropatterning sağlamak için yeni bir hücre, biyolojik bir dizi uygulamada kullanılabilir ve son derece sulu ortam içinde hücrelerin biyolojik tepkin maddelerin sağlanmasını lokalize edilmiştir. 25-32 bir oluşturmak küremsi, kanser hücreleri, sulu deksmedetomidin faz ve elde edilen süspansiyon bir alt mikrolitre damla karıştırılır iyi olarak ihtiva eden daldırma sulu PEG faz çözeltisi içine pipetlenir. damlası sfero oluşumunu kolaylaştırmak için daldırma aşaması sınırladığını hücrelerden karışmayan kalır. İthortantly yüksek sulu daldırma aşaması sfero hücrelerine besin sağlar ve ortam osmolalitesinin değişiklikler ve ilaç konsantrasyonlarının dalgalanmalara neden olur başka deneyler için ortak ortam buharlaştırma ile bilinen bir sorun en aza indirir. Bu teknik, küremsi üretim ve yalnızca standart 96 oyuklu plakalar içinde ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve pipetleme araçlarını kullanarak ilaç tedavisi sağlar. Önemli bir şekilde, küremsilerin hücresel tepkilerin analizi standart biyokimyasal tahlilleri ve plaka okuyucu kullanarak aynı plakada gerçekleştirilir. Robotik sıvı taşıma yaklaşım ATP ve adaptasyon ile çalışma kolaylığı mono-kültür ve ko-kültür hem de yüksek verim nesil basit bir laboratuar tekniği sferoitlerin yapar. Bu yeni yaklaşım, geliştirilmiş test hacmi ve test bileşiklerin ve Redu artan sayıda maliyet-etkililik (ilaç geliştirme ve keşif süreçlerine kanser hücresi sferoitlerin entegrasyonu yönünde atılmış büyük bir adım olacakCED reaktif tüketimi) ve verimlilik (zaman eller azaltıcı).
ATPS yaklaşım kullanılarak 96 oyuklu plakalar içinde kanser hücresi sferoitlerin robot üretimi için ayrıntılı bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir. Buna ek olarak, sonuçta elde edilen sferoitlerin ve ticari bir biyokimyasal analizi kullanılarak hücresel tepkilerin alt analizi ilaç tedavisi ayrıntıları sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sferoidler iyi tümör fizyolojisini ve ilaç etkinliğini anlamak ve anti-kanser ilaç keşfi için yararlı bir araç sağlamak için gerçekçi bir modeli sunuyoruz. Bu tür uygulamalar büyük ölçüde yalnızca standart laboratuar aletlerinin, sıvı taşıma araçları ve tarama ekipmanı gerektirmeyen basit sfero üretimi ve bakım teknikleri yararlanacak. sulu iki-fazlı sistemde açılan faz içinde kendiliğinden agrega kanser hücrelerinin kullanılması verimli üretim ve robotik sıvı işleyicilerle sfero…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery–a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. . Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
