قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
المقايسات الرقمية وطرق القوية التي تمكن الكشف عن خلايا نادرة وفرز الفردية جزيئات الحمض النووي. ومع ذلك، المقايسات الرقمية لا تزال لم تطبق بشكل روتيني، وذلك بسبب التكلفة ومعدات معينة المرتبطة بالطرق المتاحة تجاريا. هنا نقدم طريقة مبسطة لقراءات من المقايسات قطرة الرقمية باستخدام الوقت الحقيقي PCR التقليدية أداة لقياس مضان الجزء الأكبر من المقايسات الرقمية القائمة على الحبرية.
نحن تميز أداء فحص قراءات بالجملة باستخدام خليط من قطرة الاصطناعية وقطرات الرقمي المتعدد التضخيم التشرد (MDA) فحص. الكمية MDA ولا سيما الفوائد من تنسيق رد فعل الرقمي، ولكن ينطبق أسلوب جديد لدينا على أي فحص الرقمي. لإنشاء بروتوكولات الفحص الرقمية مثل PCR الرقمي، ويقدم طريقة لتسريع وتبسيط فحص قراءات.
لدينا منهجية قراءات الأكبر يجلب مزايا partitioneد فحوصات دون الحاجة إلى متخصص قراءات أجهزة القياس. يتم تخفيض القيود الرئيسية للمنهجية قراءات السائبة النطاق الديناميكي مقارنة مع منصات القطيرات العد والحاجة لعينة القياسية، على الرغم من أن متطلبات هذا المعيار هي أقل تطلبا من لتجربة في الوقت الحقيقي التقليدية. يستخدم الكمي كامل الجينوم التضخيم (WGA) لاختبار الملوثات في ردود الفعل وغ وهي الطريقة الأكثر حساسية للكشف عن وجود شظايا الحمض النووي مع تسلسل غير معروفة، مما يتيح أسلوب الوعد الكبير في مجالات التطبيق المختلفة بما في ذلك مراقبة الجودة الدوائية والبيولوجيا الفلكية.
Introduction
المقايسات الرقمية للحمض النووي الكمي (PCR الرقمي) 1-4 وقاعدة النظام (التسلسل) والتي تؤثر بشدة علوم الحياة والطب. توفر فحوصات الرقمية الكمي من التهم الجزيئية على نطاق المطلق (وليس نسبة إلى عنصر تحكم)، وتوفير حساسية عالية، مما المقارنات السطحية عبر التجارب، وبشكل حاسم، وتمكن من بناء قواعد البيانات الكبيرة التي تحتوي على بيانات قابلة للمقارنة 5 (الجدول 1).
على مدى السنوات ال 15 الماضية، برزت كامل الجينوم التضخيم (WGA) جنبا إلى جنب مع PCR كأداة العامة لتضخيم الحمض النووي. مثل PCR، WGA مفيد للتطبيقات التحليلية وإعدادي عن طريق تضخيم عناصر عينة دقيقة تصل إلى المستوى الذي يمكن الكشف بسهولة أو استخدامها لتحليلات لاحقة مثل قاعدة التسلسل. على عكس PCR، WGA ليست محددة لموضع DNA معين، بدلا مما يسمح التضخيم من جميع متواليات في العينة، بما في ذلك تسلسل غير معروفة.هذا الاختلاف الجوهري بين PCR وWGA يجعل الطرق مكملة لبعضها البعض، وتثير تحديات مختلفة في تطبيقها.
ارتفاع العائد من ردود الفعل وغ 6 يمكن التضخيم الروتيني من الحمض النووي الجيني من الجزيئات واحدة 7، 8 خلايا واحدة وغيرها من العينات الكتلة الحيوية منخفضة 9 لتقدير أو مزيد من التحليل. التحديات الرئيسية المرتبطة الكيمياء WGA هي الحساسية المفرطة لالملوثات والتضخيم غير المتكافئ عبر جزيئات قالب الفردية 6. برز ومع ذلك، WGA تكتسب شعبية والتسلسل وحيدة الخلية مثل "تطبيق القاتل" التكنولوجيا WGA 10، وقالب الكمي من قبل WGA المهم في العديد من مجالات التطبيق 7.
تم الأجهزة الرقمية لالكمي الحمض النووي الموصوفة سابقا في مجموعة متنوعة من محكم بصمام وعديم الصمامات الشكل ميكروفلويديكنهاية الخبر 11-14، بما في ذلك فحوصات القائم على قطرة 15،16 (الجدول 2). ومع ذلك، نظم ميكروفلويديك التجارية للتحليل الرقمي تتطلب معدات متخصصة لإعداد رد فعل وكشف المنتج 17. على microfluidics المزودة بصمامات مخصصة مرنة، ولكنها تتطلب دقة التصنيع الدقيق وأنظمة التحكم بالهواء المضغوط 18. في حين أنها بسيطة نسبيا لجعل monodisperse قطرات متناهية الصغر، التى تستند إلى مستحلب المقايسات الرقمية 19،20، قراءات رقمية هي مرهقة من الناحية الفنية، والتي تتطلب إما على نطاق واسع التصوير واسعة المجال (على غرار تقنيات التسلسل الجيل المقبل من شعبية) 21،22 أو القائم على تدفق عالية السرعة كشف قطرة 23-25. من الناحية المثالية، فإن فحص الرقمية تكون بسيطة من انشاء لقراءات، والحد من الحاجة إلى أجهزة معقدة والسماح أعداد كبيرة من العينات في أن تقرأ بسرعة. نحن هنا تصف طريقة مبسطة لقراءات من المقايسات قطرة الرقمية التي تستخدم في الوقت الحقيقي التقليدي PCR طnstrument لقياس مضان الجزء الأكبر من المقايسات الرقمية القائمة على الحبرية.
في حين أن نهج جديد يمكن تطبيقه على المقايسات PCR الرقمية، فإنه من المفيد بشكل خاص لفحوصات وغ الرقمية التي التناظرية المقايسات التضخيم في الوقت الحقيقي (التي تعطي نتائج ممتازة للPCR) هي إشكالية. يتم تطبيق WGA عادة عينات مع جزيئات قالب التي هي غير متجانسة في تسلسل، وطول، ومحتوى قاعدة. وتتضخم هذه الجزيئات قالب مختلف بمعدلات مختلفة 6، مما يستدعي استخدام إشارة ("القياسية") عينة ذات خصائص مطابقة. في كثير من الأحيان، لا يوجد مثل هذا المعيار هو متاح، أو خصائص العينات الواردة غير معروفة. عدم تجانس المواد المدخلات والممتلكات التي تعتمد على طول كيمياء WGA 26 أيضا تعقيد تفسير النتائج من خلال خلق غموض في ما يجري كميا – كتلة المدخلات، وعدد المدخلات من الجزيئات، وهو مزيج من الاثنين، أو لا. Fومكونا، للتسلسل غير خصوصية تجعل الكمي متعددة التضخيم التشرد (MDA) أكثر حساسية للتلوث من الكمي PCR منذ الجزيئات الملوثة من أي تسلسل لديها القدرة على التدخل. وتتناول المقايسات الرقمية ميكروفلويديك التلوث خلال فصل جزيئات قالب والحد من كميات رد فعل مثل أن عددا أقل من الملوثات يتم أخذ عينات.
هنا نستخدم طريقة WGA متحاور شعبية، MDA 27. وتجدر الإشارة، عدة كيمياء WGA الأخرى بما في ذلك PicoPlex وMALBAC 28 تعتمد بشكل حاسم على الخطوات النزوح متساوي الحرارة حبلا الأولية. خطوات متساوي الحرارة تؤدي إلى تفاقم التحدي المتمثل في تطبيق فحوصات في الوقت الحقيقي التناظرية لالكمي WGA. WGA لا يمكنها أن تمنع تماما أثناء الإعداد، مما يؤدي إلى متغير غير المرغوب فيها قبل التضخيم، ولا discretized ("تدوير") بطريقة حيث يمكن أن تكون مدفوعة تكرار جزيئات غير متجانسة على الانتهاء، وتوقفت قبل الدورة القادمة مثل PCR 11 </suص> (الشكل 1). صيغة الفحص الرقمي للWGA تتسع إجراءات الإعداد رد فعل نموذجية بسبب الفصل بين كل جزيء لتعداد عند نقطة الفحص (حتى ما قبل التضخيم لا يؤثر على النتائج) قراءات الأصلية تعني أن دقة مستقلة إلى حد كبير من الاختلاف في كفاءة التضخيم.
الفحص يعتمد على قطرات إنتاجها في النفط مع وحدات التخزين موحدة، حيث أن مستوى الإشارة في قطرة عند نقطة الفحص سوف تعتمد على حجم القطيرات، ونحن لا نريد اتساق النتائج تعتمد على المتوسط عبر توزيع أحجام قطرات. جعل قطرات monodisperse الآن إجراء القياسي (وقد نشرت حول 3500 أوراق قطرة monodisperse منذ 2013)، ولكنها تتطلب الأجهزة ميكروفلويديك 25. في الواقع، أكثر من ست شركات تطوير المنتجات التجارية المستقلة التي تعتمد على إنتاج مثل هذه القطرات، وصنع قطرات رقائق ميكروفلويديك هممتوفرة تجاريا 23،29. لهذه الدراسة، كنا أجهزة ميكروفلويديك مخصصة أنتجت في المنزل (انظر البروتوكول). مضخات حقنة لدفع التدفق من خلال الأجهزة وتتوفر أيضا تجاريا، ولكن بدلا من ذلك، يمكن أن تكون بديلا مع الحقنة وحيدة لتدفق يحركها الفراغ لخفض التكاليف 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
المقايسات الرقمية وطرق القوية التي تمكن الكشف عن خلايا نادرة والعد من فرد من جزيئات الحمض النووي. ومع ذلك، لا تزال لا تطبق فحوصات الرقمية بشكل روتيني في المختبرات التحليلية، ويرجع ذلك جزئيا إلى تكلفة المعدات المتخصصة المرتبطة بالطرق المتاحة تجاريا. نحن هنا وصف مقاي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
