デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
デジタルアッセイは、稀な細胞と個々の核酸分子の計数の検出を可能にする強力な方法です。しかし、デジタルアッセイはまだ日常的に市販されている方法に関連するコストや特定の機器に起因適用されません。ここでは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定するために、従来のリアルタイムPCR機器を使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を提示します。
私たちは、合成液滴の混合物と液滴デジタル複数置換増幅（MDA）アッセイを使用してバルク読み取りアッセイの性能を特徴づけます。デジタル反応形式から定量的なMDAは特に利点が、私たちの新しい方法は、任意のデジタルアッセイに適用されます。デジタルPCRのような確立されたデジタルのアッセイプロトコールについては、この方法は、スピードアップとアッセイ読み取りを単純化するのに役立ちます。
我々のバルク読み出し方法はpartitioneの利点をもたらします専門の読み出し計測を必要とせずにDアッセイ。この規格の要件は、従来のリアルタイム実験のためのより少ない厳しいですがバルク読み出し方法論の主な制限は、液滴カウントプラットフォームおよび標準試料を必要と比べてダイナミックレンジが減少しています。定量的な全ゲノム増幅（WGA）をWGA反応中の汚染物質について試験するために使用され、医薬品の品質管理及び宇宙生物学を含む多様な応用分野における方法大きな期待を与え、未知の配列を有するDNA断片の存在を検出するための最も感度の高い方法です。
Introduction
核酸定量化（デジタルPCR）1-4とベース順（シークエンシング）のためのデジタルアッセイが強く生命科学や医学に影響を与えています。デジタルアッセイは、高感度を提供する実験全体に容易な比較を可能にし、決定的に、比較可能なデータ5（ 表1）を含む大規模なデータベースの構築を可能にする、絶対的なスケール（対照と比較していない）上の分子数の定量化を提供します。
過去15年間で、全ゲノム増幅（WGA）は、核酸増幅のための一般的なツールとして、PCRと一緒に登場しました。 PCRと同様に、WGAは、容易に検出または塩基配列のようなその後の分析のために使用することができるレベルまでの分のサンプル要素を増幅することによって、分析および分取用途に有用です。 PCRとは異なり、WGAはむしろ未知の配列を含む、サンプル中のすべての配列の増幅を可能に、特定のDNA座に固有のものではありません。PCRとWGAとの間のこの根本的な違いは、互いに相補の方法を行い、そのアプリケーション内の別の課題が生じます。
WGA反応6の高収量は、単一分子7、単セル8および定量またはさらなる分析のために他の低バイオマスサンプル9からのゲノムDNAの日常的な増幅を可能にします。 WGAの化学的性質に関連する主要な課題は、その汚染物質に対する極端な感度、個々のテンプレート分子6全体で不均一に増幅しています。 WGAによってWGA技術10の「キラーアプリケーション」、およびテンプレートの定量化は、アプリケーション7の多くの分野で重要であるように、単一のセルの順序が浮上しているようしかし、WGAが人気を集めています。
デジタル核酸定量化のための計測は、以前バルブ付きとバルブレスマイクロ流体フォーマのさまざまに記載されています小滴ベースのアッセイを含むTS 11-14、15,16（ 表2）。しかし、デジタル解析用の市販のマイクロ流体システムは、反応のセットアップと製品の検出に特化した17の機器を必要とします。カスタムバルブ付きマイクロフルイディクスは、柔軟であるが、高精度の微細加工と空気圧制御システム18が必要です 。それは、エマルジ ョンベースのデジタルアッセイ19,20のために単分散の微小液滴を作ることは比較的簡単であるが、デジタル読み出しは、（人気の次世代配列決定技術に類似）のいずれかの大規模な広視野イメージング21,22を必要とする 、技術的に厄介であるか、または高速フローベースの滴検出23-25。理想的には、デジタル分析は、複雑な器具類の必要性を低減し、多数のサンプルを迅速に読み出すことができるように、読み出しにセットアップから簡単になります。ここでは、従来のリアルタイムPCR Iを使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を説明しますnstrumentは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定しました。
新しいアプローチは、デジタルPCRアッセイに適用することができるが、それは、（PCRのための優れた結果を与える）問題とリアルタイム増幅アッセイアナログれるデジタルWGAアッセイに特に有利です。 WGAは、一般的に、配列、長さ、及びベース含有量の不均一であるテンプレート分子にサンプルに適用されます。これらの異なる鋳型分子は、整合特性を有する参照（「標準」）のサンプルの使用を必要とする、異なる速度6で増幅されています。多くの場合、そのような標準が利用できない、または入ってくるサンプルの特性は不明です。入力された質量、分子の入力番号、2つ、またはいずれの組み合わせを-入力された材料の不均一性及びWGA化学の長さに依存する特性26はまた、定量化されているもので曖昧さを作成することによって、結果の解釈を複雑にします。 F任意の配列の汚染物質の分子が妨害する可能性があるためinally、配列非特異性は、定量的PCRよりも汚染に敏感定量的な複数置換増幅（MDA）をレンダリングします。マイクロ流体デジタルアッセイは、鋳型分子を分離し、より少ない汚染物質がサンプリングされるように、反応体積を減らすことによって、汚染に対処します。
ここでは、人気の等温WGA法、MDA 27を使用します 。注目すべきは、PicoPlexとMALBAC 28を含むいくつかの他のWGA化学は初期等温鎖置換手順に決定的に依存しています。等温ステップは、定量的WGAするアナログリアルタイムアッセイを適用する挑戦を悪化させます。 WGAは完全に不要な変数プレ増幅につながる、セットアップ中に防止なく、また離散化もできない（「循環」）異種の分子の複製が完了するまで駆動し、PCR前11のように、次のサイクルに停止することができる方法で、 </suP>（ 図1）。 WGAのためのデジタルアッセイ形式は、（そのように前増幅は、結果には影響しません）アッセイエンドポイントでの列挙のための各分子の分離に起因する典型的な反応セットアップ手順をaccomodates元の読み出しが精度が増幅効率の変動に大きく依存することになることを意味します。
アッセイエンドポイントでの1滴あたりの信号レベルは液滴量に依存することになるようアッセイは、均一な体積で油中に生成される液滴に依存しており、我々は結果の一貫性は、液滴サイズの分布全体に平均化に依存する必要はありません。単分散液滴を作ることになりました（約3,500単分散液滴の論文は2013年以降に発行された）標準的な手順ですが、マイクロ流体計測器25を必要とします 。実際には、以上の6社は、このような液滴の生産に依存している独立した商用製品を開発している、と液滴作りのマイクロ流体チップは、23,29市販。この研究のために、私たちは内製のカスタムマイクロ流体デバイスを（プロトコルを参照）を使用しました。デバイスを通る流れを駆動するためのシリンジポンプはまた、市販されているが、代替的に、コストを削減する30真空駆動流のための単一の使い捨て注射器で置換することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
デジタルアッセイは、希少細胞の検出、および核酸分子の個々のカウントを可能にする強力な方法です。しかし、デジタルのアッセイは、まだ日常的に市販されている方法に関連する特殊な装置のコストを部分的には、分析ラボで適用によるものではありません。ここでは、標準的なリアルタイム定量PCR装置を用いて簡略化したアナログ読み出しと核酸を定量するためのエンドポイントのデ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
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