This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Proteomische experimenten massaspectrometrie (MS) gebruikt kan worden ontworpen om hetzij niet-gerichte (shotgun) of gerichte methoden. Discovery proteomics in het algemeen via bottom-up shotgun MS, hetzij een traditionele data-afhankelijke acquisitiemodus, of door één van de recent ontwikkelde data-onafhankelijke technieken (bijvoorbeeld MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel voor high-throughput peptide identificatie en relatieve kwantificatie, maar het is doorgaans ongeschikt voor absolute kwantificering of targeting kleine gedefinieerd sets (~ tientallen) van eiwitten. De MS methode meestal gebruikt voor gerichte proteomics is selected reaction monitoring (SRM) vanwege zijn hoge gevoeligheid, snelheid en dynamisch bereik 3-5. Alternatieven voor SRM omvatten parallelle reactie monitoring, die gebruik maakt van een hoge resolutie, volledige MS scannen 6.
SRM wordt gewoonlijk uitgevoerd met een nano-flow galmsed-phase high-performance liquid chromatography (nano-RP-LC) instrument gekoppeld met een nano-electrospray ionisatie (nano-ESI) ion source verbonden met een drievoudige quadrupool massaspectrometer (QqQ-MS). In een typisch experiment worden monstereiwitten proteolytisch geknipt en de resulterende peptiden chromatografisch gescheiden gedesorbeerd en geïoniseerd. De resulterende voorloper ionen m / z gefilterd door de eerste quadrupool (Q1) en gefragmenteerde in de tweede quadrupool (Q2) door botsing ze met een botsing gas. Het resulterende fragment ionen m / z-gefilterd in de derde quadrupool (Q3) en gekwantificeerd met een dynode. Elke precursor en fragment ionenpaar wordt aangeduid als een overgang, en elke overgang wordt gecontroleerd op een bepaalde periode (de wachttijd; meestal 2-50 msec). In LC-SRM, de QqQ-MS wordt naar het vooraf gedefinieerde lijst van overgangen (de duty cycle typisch ≤3 sec) en een chromatogram van elke overgang wordt geproduceerd.
Alternatieve strategven voor eiwithoudende kwantificering maken gewoonlijk gebruik van immunoassays zoals dot blots, Western blots, ELISA's, antilichaam microarrays, omgekeerde fase proteïne microarrays, microfluïdische immunoassays, digitale ELISA en microbolletjes gebaseerde immunoassays 7. De beste immunoassays kunnen aanzienlijk gevoeliger dan LC-SRM en monsterdoorvoer immunoassays aanzienlijk hoger dan die van LC-SRM 5 zijn. Echter, de ontwikkeling immunoassays duur en / of tijdrovend en de resulterende assays kunnen kwetsbaar voor kruisreactiviteit en / of interferentie, onverenigbaar met cel / weefsel lysis / homogeniseren methoden en / of niet vatbaar multiplexen 5,8. Sommige van deze problemen kunnen worden aangepakt door het koppelen van antilichaam en MS-gebaseerde technieken. Zo kunnen doeleiwitten worden verrijkt met behulp van immunoprecipitatie voorafgaand aan proteolyse en LC-SRM 9-12. Als alternatief kan de SISCAPA techniek maakt gebruik van immunoprecipitatie na proteolyse in het peptide level 13,14. Naast strategieën immunoenrichment, kan immunodepletie hoge overvloed eiwitten worden gebruikt om LC-SRM gevoeligheid te verhogen door het verminderen van interferentie door coeluting analyten 15,16.
MS-eiwitten gekwantificeerd kan worden onderverdeeld in relatieve en absolute kwantificatie en eveneens in-label vrij en stabiele isotopen (bijvoorbeeld metabolisch merken, chemische labeling en zware-gemerkt eiwit en peptide interne standaarden). Label-free technieken kunnen nuttig zijn voor de relatieve eiwit kwantificatie zijn, maar zijn niet geschikt voor nauwkeurige absolute kwantificatie. Ter vergelijking zijn labeltechnieken foutenbronnen bij monstervoorbereiding en MS variantie verminderd en worden vaak gebruikt voor relatieve kwantificatie eiwit 17. Bijvoorbeeld, stabiele isotoop gemerkte proteoom (SILAP) standaarden bereid met een gekweekte menselijke cellijn ingeschakeld relatieve kwantificering van potentiële biomarkers via LC-SRM van humaan serum 18. Accurate absolute eiwit kwantificering door MS vereist dat gezuiverd, gekwantificeerd, isotopisch gemerkt eiwit of peptide interne standaarden worden spiked-in biologische monsters voorafgaande aan MS. De opname van zware isotoop gelabelde interne standaarden in een LC-SRM workflow maakt absolute kwantificatie waarvan is aangetoond zeer reproduceerbare en overdraagbaar laboratoria 16,19 zijn.
Stabiele isotopen gelabelde interne standaarden voor de absolute kwantificering van eiwit MS omvatten peptide standaarden bereid met vaste fase synthese 20, eiwitten uit aaneengeschakelde protease splitsbare peptide standaarden 21 en full-length eiwitstandaards 22. Doelproteïne covalente modificatie en onvolledige monstervoorbereiding (dwz onvolledige sample lysis en homogenisering, en onvolledige eiwit oplosbaar, denaturatie, alkylering en proteolyse) kan accurate kwantificering ondermijnen. Interne pProtein normen het minst waarschijnlijk worden beïnvloed door de meeste van deze potentiële problemen, maar deze zijn meestal de meest moeilijk te bereiden. Een alternatief is om elk doelwit eiwit met meerdere interne peptide standaarden die zijn ontworpen om amino- en carboxy-eindstandige natieve flankerende resten omvatten analyseren. Ongeacht welk type interne standaard wordt gebruikt, moet worden spiked-in biologische monsters in een zo vroeg punt tijdens de voorbehandeling mogelijk. Ook moet meerdere monstervoorbereiding technieken (bijvoorbeeld verschillende denaturatie omstandigheden) worden getest. Het gebruik van meerdere orthogonale experimentele technieken (experimentele cross-validatie) is een haalbare strategie voor het overwinnen van de meeste potentiële kwantificering daagt 23-25.
LC-SRM kwantificering van eiwitten is een zeer flexibele techniek die is gebruikt in vele verschillende toepassingen. Met name is het gebruikt om peptide en proteïne biomarkers studie binnenklinische monsters zoals serum, kern biopsies en naaldopzuigingen 5. LC-SRM is ook gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen 5,26 meten, botulinum neurotoxinen 27 detecteren, te kwantificeren proteïne fosforylatie dynamiek binnen signaalwegen 5 en wijzigingen in eiwitconformatie 28 kwantificeren.
Ons laboratorium gebruikt LC-SRM de signalering eiwitten die chemotaxis van macrofagen mediëren de ontwikkeling van chemotaxis traject simulaties ondersteunen kwantificeren. De algemene regeling van het protocol (figuur 1) begint met de rangschikking van de voorlopige targetpeptiden. Vervolgens worden ruwe peptide externe standaarden gesynthetiseerd en LC-SRM assays voor kwalitatieve analyses van biologische monsters te ontwikkelen. Als het biologisch monster afgeleid doelwit peptide wordt gedetecteerd, worden gezuiverd heavy-gelabelde interne peptide normen opgesteld voor de kwantitatieve LC-SRM. Dit protocol kan worden gebruikt om ACcurately kwantificeren eiwitten uit diverse biologische monsters, en onderzoeken van diverse eiwit targets ondersteunen.
Absolute eiwit kwantificering is essentieel voor een zeer divers aanbod van biomedische toepassingen zoals biomarker validatie en signaaltransductiepad modellering. Onlangs, gerichte proteomics met behulp van LC-SRM heeft geprofiteerd van verbeteringen in tal van technologieën, waaronder peptide standaard voorbereiding, HPLC, QqQ-MS en LC-SRM data-analyse. Bijgevolg is het uitgegroeid tot een krachtig alternatief voor immunoassays. Immunoassays kunnen zeer gevoelig en high-throughput, maar ontwikkeling van een robuust …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
Urea | Sigma | U0631-500g | |
Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |