Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
Expériences protéomiques qui utilisent la spectrométrie de masse (MS) peuvent être conçus pour utiliser soit non ciblée (fusil de chasse) ou des méthodes ciblées. protéomique de découverte repose généralement sur shotgun bottom-up MS, soit en utilisant un mode d'acquisition traditionnelle dépendant des données, ou en utilisant l'une des techniques de données indépendante récemment développés (par exemple, MS E, COULOIR) 1,2. Protéomique fusil de chasse est un outil puissant pour l'identification à haut débit de peptide et la quantification relative, mais il est généralement impropre à la quantification absolue ou pour cibler les petits ensembles définis (~ RTE) de protéines. La méthode de MS le plus souvent utilisé pour la protéomique ciblées est sélectionné surveillance de réaction (SRM) en raison de sa haute sensibilité, la vitesse, et la gamme dynamique 3-5. Alternatives à SRM comprennent la surveillance de réaction parallèle, qui tire parti de haute résolution, MS balayage complet 6.
SRM est habituellement effectuée en utilisant un rever nano-débitChromatographie sed phase liquide à haute performance (nano-RP-LC) couplée à un instrument ionisation nano-électrospray (nano-ESI) source d'ions attaché à un spectromètre de masse triple quadripôle (QQQ-MS). Dans une expérience typique, les protéines de l'échantillon sont digérés par protéolyse, et les peptides obtenus sont séparés par chromatographie, désorbés, et ionisés. Les ions précurseurs qui en résultent sont m / z filtré par le premier quadrupôle (Q1) et fragmentée dans le deuxième quadrupôle (Q2) par les collisions avec un gaz de collision. Les ions fragments résultant sont m / z-filtré dans le troisième quadrupôle (Q3) et quantifié par une dynode. Chaque paire de précurseur et ion de fragment est considéré comme une transition, et chaque transition est surveillée pour une période déterminée de temps (le temps de séjour; typiquement 2-50 msec). Pendant LC-SRM, les cycles QQQ-MS à travers une liste prédéfinie de transitions (le cycle de service est généralement ≤3 sec), et un chromatogramme de chaque transition est produite.
Alternative stratégs pour la quantification des protéines utilisent généralement des dosages immunologiques tels que des transferts de points, des transferts de Western, ELISA, anticorps, puces inverse des puces à protéines de phase, immunoessais microfluidiques, ELISA numériques et immunoessais base microsphères-7. Les meilleurs dosages immunologiques peuvent être beaucoup plus sensibles que les LC-SRM, et le débit de l'échantillon des immunodosages peuvent être significativement supérieur à celui de LC-SRM 5. Cependant, immunoessais en développement peuvent être coûteux et / ou de temps, et les dosages en résultent peuvent être vulnérables à la réactivité croisée et / ou des interférences, incompatible avec la cellule / lyse des tissus / méthodes d'homogénéisation et / ou ne se prêtent pas au multiplexage 5,8. Certains de ces problèmes peuvent être résolus par couplage techniques anticorps-et MS. Par exemple, les protéines cibles peuvent être enrichies en utilisant une immunoprécipitation préalable à la protéolyse et LC-SRM 12/09. En variante, la technique d'immunoprécipitation SISCAPA emploie ultérieure à la protéolyse à la leve peptidiquel 13,14. En plus des stratégies immunoenrichment, immunodéplétion de protéines de grande abondance peut être utilisé pour augmenter la sensibilité LC-SRM en réduisant les interférences par coélution analytes 15,16.
Quantification des protéines MS peut être divisé en quantification relative et absolue, et aussi dans et stable sans marqueur isotopique étiquetage (par exemple, l'étiquetage métabolique, l'étiquetage des produits chimiques, et de protéines lourde marqué et peptidiques normes internes). Techniques sans étiquette peut être utile pour la quantification des protéines rapport, mais ne conviennent pas pour la quantification absolue précision. Par comparaison, les techniques de marquage ont réduit erreur associée à la préparation de l'échantillon et la variance MS, et sont souvent utilisés pour la protéine par rapport quantification 17. Par exemple, les normes (Silap) des isotopes stables du protéome marqué préparés en utilisant une lignée cellulaire humaine cultivées permis quantification relative de biomarqueurs potentiels via LC-SRM de sérum humain 18. Absolue précise la quantification des protéines par MS exige que les normes internes purifiée, quantifiés, protéines ou peptides marqués par des isotopes être dopés-en échantillons biologiques avant MS. L'incorporation des normes internes marqués d'isotopes lourd dans un flux de travail LC-SRM permet une quantification absolue qui a été montré pour être hautement reproductible et transférable entre les laboratoires 16,19.
Isotopes stables étiquetés normes internes pour la protéine absolue quantification par MS comprennent des normes peptidiques préparés en utilisant la synthèse en phase solide 20, composées de protéines normes peptidiques de la protéase clivable concaténés 21, et 22 normes protéines pleine longueur. Cible de modification covalente de protéines et de préparation de l'échantillon incomplet (c.-à-lyse incomplète de l'échantillon et l'homogénéisation, et incomplète solubilisation de la protéine, dénaturation, alkylation, et la protéolyse) peut nuire à une quantification précise. P internerotein normes sont les moins susceptibles d'être affectés par la plupart de ces problèmes potentiels, mais ils sont généralement les plus difficiles à préparer. Une alternative consiste à analyser chaque protéine cible à l'aide de multiples normes de peptides internes qui sont conçues pour inclure des résidus flanquant natifs amino et du carboxy terminal. Indépendamment du type de l'étalon interne est utilisé, il doit être enrichi dans les échantillons-biologiques au plus tôt un point lors de la préparation de l'échantillon que possible. En outre, les techniques de préparation d'échantillons multiples (par exemple, différentes conditions de dénaturation) doivent être testés. L'utilisation de plusieurs techniques expérimentales orthogonales (cross-validation expérimentale) est une stratégie viable pour surmonter les plus quantification potentiel défis 23-25.
LC-SRM quantification de protéines est une technique très souple qui a été utilisée dans une grande variété d'applications. Notamment, il a été utilisé pour étudier peptides et de protéines à l'intérieur de biomarqueurséchantillons cliniques tels que le sérum, les biopsies de base, et des aspirations à l'aiguille fine 5. LC-SRM a également été utilisée pour mesurer la stoechiométrie des complexes protéiques 5,26, pour détecter des neurotoxines botuliniques 27, pour quantifier la dynamique de phosphorylation de protéine à l'intérieur des voies de signalisation 5, et à quantifier des changements dans la conformation des protéines 28.
Notre laboratoire utilise LC-SRM pour quantifier les protéines de signalisation qui interviennent dans le chimiotactisme des macrophages pour soutenir le développement de simulations de la voie de la chimiotaxie. Le schéma global du protocole (Figure 1) commence avec le classement des peptides cibles provisoires. Par la suite, les normes peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests LC-SRM pour des analyses qualitatives des échantillons biologiques. Si le peptide cible biologique de l'échantillon dérivé est détectée, les normes lourds marqué purifiés peptidiques internes sont préparés pour quantitative LC-SRM. Ce protocole peut être utilisé pour acquantifier curately protéines à partir d'une grande variété d'échantillons biologiques, et d'appuyer les enquêtes d'une grande variété de protéines cibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Absolute quantification de protéine est essentielle pour une gamme très diversifiée d'applications biomédicales telles que la validation de biomarqueurs et la transduction du signal de modélisation de la voie. Récemment, la protéomique ciblées utilisant LC-SRM a bénéficié des améliorations apportées à de nombreuses technologies, y compris peptide préparation standard, HPLC, QQQ-MS et LC-SRM analyse des données. Par conséquent, il est devenu une alternative puissante aux immunoessais. Immunoessais pe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. . The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. . Peptide synthesis and applications. , (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2001).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. . Amino acid analysis : methods and protocols. , (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. . Mol Cell Proteomics. , .
