Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Summary

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Abstract

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of G_i2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.

Introduction

Proteomic eksperimenter som bruker massespektrometri (MS) kan være konstruert for å bruke enten ikke-målrettede (hagle) eller målrettede metoder. Discovery proteomikk generelt er avhengig av bottom-up hagle MS, enten ved hjelp av en tradisjonell dataavhengig oppkjøpet modus, eller ved å bruke en av de nyutviklede datauavhengig teknikker (for eksempel MS ^E, SWATH) ^1,2. Hagle proteomikk er et kraftig verktøy for høy gjennomstrømming peptid identifikasjon og relativ kvantifisering, men det er generelt uegnet for absolutt kvantifisering eller for målretting små, definert sett (~ titalls) av proteiner. MS metode som oftest brukes for målrettede proteomforskning er valgt reaksjon overvåkning (SRM) på grunn av sin høye følsomhet, hastighet og dynamisk område ^3-5. Alternativer til SRM inkluderer parallell reaksjon overvåking, som tar fordel av høy oppløsning, full MS skanning ^6.

SRM er vanligvis utføres ved hjelp av en nano-flow reversed-fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-nano-LC) instrument koblet til en nano-elektrospray ionisering (nano-ESI) ionekilden er koblet til en trippel kvadrupol massespektrometer (QQQ-MS). I et typisk eksperiment, blir prøveproteiner proteolytisk spaltet, og de resulterende peptider separeres kromatografisk, desorberes, og ionisert. De resulterende forløper-ioner m / z filtrert av det første kvadrupol (Q1) og fragmentert i den andre kvadrupol (q2) ved å kollidere dem med en kollisjon gass. De resulterende fragmentioner er m / z-filtreres i det tredje kvadrupol (Q3), og kvantifiseres ved en dynode. Hver forløper og fragment ionepar er referert til som en overgang, og hver overgang overvåkes for en bestemt tidsperiode (oppholdstiden, vanligvis 2-50 msek). Under LC-SRM, de Qqq-MS blar gjennom en forhåndsdefinert liste over overganger (driftssyklus er vanligvis ≤3 sek), og et kromatogram av hver overgang er produsert.

Alternativ strategkaper for protein kvantifisering vanligvis bruker immunoassays som punkt blotter, Western blot, ELISA, antistoff mikromatriser, reversfaseemulsjoner protein microarrays, microfluidic immunoassays, digitale ELISAer og mikrobaserte immunoassays ^7. De beste immunanalyser kan bli vesentlig mer følsomme enn LC-SRM, og prøvekapasitet av immunanalyser kan være betydelig høyere enn for LC-SRM ^5. Imidlertid kan utvikle immunoanalyser være dyrt og / eller tidskrevende, og de ​​resulterende analyser kan være utsatt for kryss-reaktivitet og / eller interferens, uforenlig med celle / vev lyse / homogenisering metoder, og / eller ikke mottagelig for multiplekses ^5,8. Noen av disse problemene kan løses ved å koble antistoff, og MS-baserte teknikker. For eksempel kan målproteiner bli beriket ved hjelp immunopresipitering før proteolyse og LC-SRM ^9-12. Alternativt benytter SISCAPA teknikken immunpresipitering etterkant proteolyse på peptid level ^13,14. I tillegg til immunoenrichment strategier, kan immunodepletion av høye overflod proteiner brukes til å øke LC-SRM følsomhet ved å redusere interferensen ved coeluting analytter ^15,16.

MS-baserte protein kvantifisering kan deles inn i relativ og absolutt kvantifisering, og også inn i etikett-fri og stabil isotop merking (f.eks, metabolsk merking, kjemisk merking og tung-merkede proteiner og peptider interne standarder). Etikettfrie teknikker kan være nyttig for kvantifisering relativ protein, men er uegnet for nøyaktig absolutt kvantifisering. Til sammenligning har merkingsteknikker reduseres feilen tilknyttet prøvepreparering og MS varians, og blir ofte brukt for relativ protein kvantifisering ^17. For eksempel, stabile isotoper merket proteomet (SILAP) standarder utarbeidet med en kultivert human cellelinje aktivert relativ kvantifisering av potensielle biomarkører via LC-SRM av humant serum ¹⁸. Nøyaktig absolutt protein kvantifisering av MS krever at renset, kvantifisert, isotopisk merket protein eller peptid interne standarder bli tilsatt-inn biologiske prøver før MS. Inkorporering av tunge isotopen merkede interne standarder i en LC-SRM arbeidsflyt muliggjør absolutt kvantifisering som har vist seg å være meget reproduserbar og overførbar mellom laboratorier ^16,19.

Stabile isotoper merket intern standard for protein absolutt kvantifisering av MS er peptid-standarder fremstilles ved hjelp av fast fasesyntese ^20, proteiner sammensatt av sammenkjedede protease-spaltbar peptid krav ^21, og full-lengde protein krav ^22. Målprotein kovalent modifikasjon og ufullstendig prøvepreparering (dvs. ufullstendig prøven lysering og homogenisering, og ufullstendige protein oppløseliggjøring, denaturering, alkylering, og proteolyse) kan undergrave nøyaktig kvantifisering. Intern protein standarder er minst sannsynlig å bli påvirket av de fleste av disse potensielle problemene, men de er vanligvis den mest vanskelig å tilberede. Et alternativ er å analysere hvert mål-protein ved hjelp av flere interne standarder peptid som er utformet for å omfatte amino- og karboksy-terminale flankerende innfødte rester. Uavhengig av hvilken type av intern standard blir benyttet, bør det tilsatt-i de biologiske prøvene på et så tidlig tidspunkt under som mulig prøvepreparering. I tillegg bør flere prøveprepareringsteknikker (f.eks forskjellige denatureringsbetingelser) skal testes. Bruken av flere ortogonale eksperimentelle teknikker (eksperimentell kryss-validering) er en levedyktig strategi for å overvinne størst potensial kvantifisering utfordrer ^23-25.

LC-SRM kvantifisering av proteiner er en svært fleksibel teknikk som har vært brukt i en lang rekke anvendelser. Spesielt, har det blitt brukt til å studere peptid og protein biomarkører innenforkliniske prøver som serum, kjerne biopsier, og tynn nål aspirates ^5. LC-SRM har også blitt brukt for å måle støkiometrien av proteinkomplekser ^5,26, for å detektere botulinum nervegifter ^27, for å kvantifisere protein fosforylering dynamikken på signalveier ^5, samt kvantifisering av endringer i protein ²⁸ konformasjon.

Vårt laboratorium bruker LC-SRM å kvantifisere signalproteiner som formidler makro kjemotaksis å støtte utviklingen av kjemotaksis sti simuleringer. Den generelle ordningen med protokollen (figur 1) begynner med rangering av tentative mål peptider. Deretter blir rå peptid eksterne standarder syntetisert og brukt til å utvikle LC-SRM-analyser for kvalitative analyser av biologiske prøver. Hvis det oppdages den biologiske prøven-avledet målpeptid blir renset tunge merkede interne peptid standarder utarbeidet for kvantitativ LC-SRM. Denne protokollen kan brukes til accurately kvantifisere proteiner fra et bredt spekter av biologiske prøver, og til å støtte undersøkelser av en rekke forskjellige protein mål.

Protocol

MERK: Denne metoden er tidligere beskrevet 56. 1. Peptide Target Selection Kompilere en liste over målproteinene, og inkluderer et lite antall renholds proteiner for normalisering over biologiske prøver, og inkluderer også en intern protein standard (f.eks ildflueluciferase). Fordøye målproteinene inn tryptiske peptider i silico bruker et verktøy som Protein Fordøyelse Simulator 29,30. Krev at peptidene er fullt tryptisk og …

Representative Results

Utviklingen av prediktive beregnings modeller av signaloverføringsreaksjonsveier er en av de fundamentale mål for systembiologi 53. Dessverre, selv for signalveier som har blitt studert mye og har en høy klinisk betydning, er det fortsatt ikke generelt mulig å kvantitativt forutsi pathway atferd som respons på forstyrrelser (f.eks, dette er sant for MAPK / ERK vei 54). Nylig, en etterforskning ansatt målrettede proteomikk, transcriptomics, og beregningsorientert modellering og simule…

Discussion

Absolute protein kvantifisering er avgjørende for et svært variert spekter av biomedisinske applikasjoner som biomarkør validering og signaltransduksjonsbane modellering. Nylig har målrettede proteomikk ved hjelp av LC-SRM dratt nytte av forbedringer til en rekke teknologier, inkludert peptid standard forberedelse, HPLC, Qqq-MS, og LC-SRM dataanalyse. Derfor har det blitt en kraftig alternativ til immunoassays. Immunoanalyser kan være ekstremt sensitiv og high-throughput, men utvikling av en robust immunoassay kan …

Materials

Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit	Fisher	23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm	BioSpec Products	11079101z
Bestatin hydrochloride	Sigma	B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)	Lonza	12-614F
Cell culture EDTA, 500mM, pH8	Gibco	15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550
Cell culture L-glutamine	Sigma	G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco	10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v	Lonza	17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules	Fisher	A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep	Marienfeld-Superior	0640030
HEPES, 1M, pH 7.2	Mediatech	25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000
LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media	Michrom Bioresources	PM5/61200/00
LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media	Michrom Bioresources	PM3/93100/00
LC coated silica capillary, 50µm id	Polymicro Technologies	1068150017
LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene	SUN SRI	200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone	SUN SRI	500-061
Luciferase, from Photinus pyralis	Sigma	L9506-1MG
Pepstatin A	EMD Millipore	516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)	EMD Chemicals	9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail	Roche	04906837001
RapiGest SF	Waters	186001861
Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge	Waters	WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position	Waters	WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb	Fisher	03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
SpeedVac vacuum concentrator	Fisher	SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Tube decapper for Micronic tubes	USA Scientific	1765-4000
Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile	Sarstedt	72.694.006
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS grade	Fisher	W6-1