Summary
De novo Lipogenese und β-Oxidation von Fettsäuren bilden Schlüsselstoffwechselwege in Hepatozyten, Wege, die in mehreren Stoffwechselstörungen, einschließlich Fettleber gestört werden. Hier zeigen wir Isolierung von Maus primären Hepatozyten und zu beschreiben, die Quantifizierung der β-Oxidation von Fettsäuren und Lipogenese.
Protocol
Alle Tierversuche sollten in Übereinstimmung mit den örtlichen und nationalen Vorschriften und mit der Zustimmung eines institutionellen IACUC und Strahlungssicherheit Verwaltung durchgeführt werden.
1. Vorbereitung
- Einige Tage vor dem Test, tauen die 500 ml Flasche Liver Digest Medium (LDM) und wieder einfrieren ~ 35 ml Aliquots in 50 ml konischen Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C, bis sie benötigt.
- Einen Tag vor dem Assay, pre-sterilisiert sauberen Dissektion Tools von Autoklaven.
- Am Tag des Assays, behandeln die notwendige Menge von 24-Well-Kulturplatten mit Collagen.
- 1 Teil von 3 mg / ml Rattenschwanzkollagen mit 50 Teilen PBS. In etwa 500 & mgr; l in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und Inkubation für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie die Kollagen und lassen Sie die Platte trocken in der Haube in die Luft. Wiederholen wenigstens ein weiteres Mal.
Hinweis: Collagen-Beschichtung kann bis zu einer Woche in ad durchgeführt werdenVance und Platten bei 4 ° C in Plastikfolie abgedichtet gelagert.
- 1 Teil von 3 mg / ml Rattenschwanzkollagen mit 50 Teilen PBS. In etwa 500 & mgr; l in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und Inkubation für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie die Kollagen und lassen Sie die Platte trocken in der Haube in die Luft. Wiederholen wenigstens ein weiteres Mal.
- Bereiten LDM für Assay: Thaw LDM und warm bis 37 ° C und pH-Wert auf 7,4 mit 1 N KOH. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter und in einen Umluft 42 ° C Wasserbad.
- Warm 25 ml Leberperfusion Medium auf 42 ° C im Umluft Wasserbad.
- Vorbereitung 90% kolloidales Siliciumdioxid, das mit Polyvinylpyrrolidon-Lösung überzogen: 1 ml 10x DPBS zu 9 ml kolloidaler Kieselsäure mit Polyvinylpyrrolidon beschichtet. Einstellen des pH auf 7,4 unter Verwendung von 0,1 N HCl. Filter mit einer sterilen 0,2 & mgr; m Spritzenfilter filtriert. Lagern bei RT.
- Warm Plating Medium auf 37 ° C.
2. Isolierung von Primär Maushepatozyten
- Einrichten peristaltische Pumpe, Schläuche und Dissektionstisch: Sterilisieren Schlauch durch Spülen mit 5 ml 70% Ethanol in destilliertem Wasser, gefolgt von 10 ml sterilem Wasser. Zeigen Schlauch in Leberperfusion Medium und führen Pumpe zu füllengesamte Rohrlänge.
- Opfern Maus durch die institutionell genehmigten Methode.
- Sezieren offen die Bauchhöhle: Sprühen Sie die Mausunterleib zügig mit 70% Ethanol. Verwendung blunt-end Schere, einen Mittelschnitt durch die Dermis die Länge der Bauch und seitlich reflektieren. Einen ähnlichen Schnitt in der Bauchfell, um die Eingeweide aus.
- Mit einem stumpfen Gegenstand vorsichtig zu verdrängen den Darm zu entlarven die Bauchgefäß Suchen Sie die Bauch untere Hohlvene (IVC) und legen Sie eine Naht unter dem Blutgefäß, distal der Nierenvenen
- Distal des Nahtmaterials Platzieren einer Nadel und der Katheter in die IVC, Vorschieben über das Niveau des Fadens. Mit der Nadel noch vorhanden, binden die Naht um den Katheter, um es in Position zu halten. Die Nadel vorsichtig entfernen. Wenn es richtig mit Fluss durch den Katheter durchgeführt, Blut.
- Unter Verwendung einer Pipette, füllen Sie die restliche Fläche in dem Katheter mit Perfusionsmedium, sicherzustellen,daß keine Luft vorhanden ist. Mit großer Sorgfalt, befestigen Sie den Schlauch mit dem Katheter.
- Sezieren offen die Lunge Hohlraum: sanft spiegeln die überlegene Leberlappen, um die Membran freizulegen. Sorgfältig durchstechen die Membran mit scharfen Spitze Schere, dann machen Sie eine laterale Inzision, um die Brusthöhle freizulegen, kümmert sich um die Gallenblase und Pleura Gefäßsystem zu vermeiden. Legen Sie eine Bulldogge Schelle um den Brust untere Hohlvene gerade proximal der Lebervene.
- Schneiden Sie die Pfortader und schalten Sie die Pumpe mit einem 3 - 4 ml / min. Perfusion der Leber Leberperfusion Medium für 5 min unter Verwendung von etwa 20 ml Perfusionsmedium.
Hinweis: Die Leber sollten sofort von Rot zu ändern bis grau / tan. Wenn Teile der Leber rot bleiben, dürfte dies deutet auf eine schlechte Durchblutung, und die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Isolierung stark vermindert. Während der Perfusion, seien Sie vorsichtig, um das Medium nicht auslaufen zu gewährleisten, und dass keine Luftblasen geben Sie die Schläuche. - Nach 5 min Inkubation stoppendie Pumpe und übertragen Sie den Schlauch an Leber Digest Medium. Starten Sie die Pumpe und Perfusion der Leber für eine weitere 10 bis 15 min (bis das Medium erschöpft ist).
- Am Ende der Durchblutung, die Pumpe stoppen. Die Leber ist ein rosa Farbton haben und scheinen etwas vergrößert. Auszuschneiden die Leber durch sorgfältige Dissektion. Entfernen Sie die Gallenblase und übertragen die Leber zu 10 cm Gewebekulturschale.
- In einer Biosicherheitswerkbank, 10 ml Plating Medium (Tabelle 1) in die Leber. Kratzen Sie vorsichtig die Leber unter Verwendung entweder einer Pinzette oder einem Skalpell, um die Leberzellen zu entfernen. Filtern der Suspension unter Verwendung eines 100 & mgr; m Zellsieb und in ein konisches 50 ml-Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit weiteren 10 ml Plattierungsmedium und Pool in der 50 ml konischen Röhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min bei 350 × g, 4 ° C.
- Saugen Sie mittel- und Pellet in 10 ml Plattierungsmedium und 10 ml 90% kolloidaler Kieselsäure mit po beschichtetlyvinylpyrrolidone. Vorsichtig mischen und Zentrifuge wie in Schritt 2.11. Nach der Zentrifugation wird eine Schicht aus toten Zellen werden auf der Oberseite der Mischung schwimmt, während die lebenden Zellen auf den Grund zu pelletieren.
- Saugen Sie abgestorbenen Zellen und Medium. Mit 20 ml Plattierungsmedium, Zentrifuge 2.11 waschen 2 mal.
- Die Zellen in 10 ml Medium Überzug. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und legen 9 x 10 4 Zellen / Vertiefung in Kollagen behandelten 24-Well-Kulturschalen. Inkubieren in einem 37 ° C Brutschrank für 2 Std. Jede Platte kann entweder für die Fettsäure-Oxidation Assay oder der Lipogenese-Assay verwendet werden.
- Optional Brunnen verändern Wartung Medium (Tabelle 1) und die Kultur bei 37 ° C. 3 Tage, ohne die Testergebnisse - Zellen für 2 kultiviert werden.
3. Fettsäure-Oxidationsassay
Warnung: Verwenden von Radioaktivität kann gefährlich sein. Alle Einkauf, Lagerung, Handhabung, und diEntsorgungsbetrieb von radioaktivem Material sollte in Übereinstimmung mit den institutionellen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften und Richtlinien ausgeführt werden.
- 16 bis 20 h vor dem Assay, waschen Zellen 2 mal mit warmem PBS. Ändern die Zellen an serumfreies Serumentzugs-Medium (Tabelle 1) mit 20 nM Glucagon und Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
Anmerkung: Da fötales Rinderserum enthält eine unbekannte Konzentration von Stoffwechsel Hormone (zB Insulin, Glukagon), Serum hungern die Zellen keine Verwechslung sich daraus für den Assay haben kann. Zellen lebensfähig in Serumhungermedium für> 24 h. Glucagon Behandlung wird verwendet, um die Oxidation von Fettsäuren in den Leberzellen zu stimulieren. - Am Morgen des Tests vorzubereiten Vorinkubationsmedium: Resuspendieren eine entsprechende Menge an Natriumpalmitat in ultrareinem Wasser, um eine 100 mM Lösung und Wärme bis 70 ° C für 10 min zu machen. In der Zwischenzeit bereiten die erforderliche Menge (0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte)DMEM mit 25 mM HEPES, 1% BSA Fraktion V, und 20 nM Glucagon. Wärme auf 37 ° C.
- Einmal solubilisiert hinzuzufügen Palmitate auf eine Endkonzentration von 250 & mgr; M zu dem Medium. Ändern Hepatozyten zu Vorinkubationsmedium und bei 37 ° C für 2 Stunden. Behalten einige Vorinkubationsmedium bei 37 ° C für die spätere Verwendung.
- Während der Inkubation Trocknen eine geeignete Menge an 14 C-Palmitat (0,5 uCi / Vertiefung) durch Verdampfung unter Stickstoff.
- Zum Beispiel, um 24 Proben in einem 24-Well-Platte zu messen, Transfer 120 ul 0,1 & mgr; Ci / ml 14 C-Palmitate in ein 1,5-ml-Tube. Langsam verdampft das Ethanol-Lösungsmittel durch Einblasen von Stickstoffgas über die Lösung in einem Abstand von 3-5 cm in einem Abzug. Das Lösungsmittel sollte in etwa 30 verdampfen - 40 min, wobei Trocken 14 C-Palmitat im Boden des Röhrchens.
- Ca. 15 min vor dem Ende der Inkubation resuspendieren 14C-Palmitate in 0,1 N NaOH (12,5 ul / & mgr; Ci). Inkubieren bei 70 ° C für 10 min. In drei Bänden der warmen Vorinkubationsmedium und mischen durch Auf-und Abpipettieren.
- Spike jede Vertiefung mit 25 ul verdünnt 14 C-Palmitate. Mischen Sie durch vorsichtiges Schwenken der Platte und bei 37 ° C für 90 min. Dies ist die Testplatte.
- Während der Inkubation, bereiten Sie die Filter Pappteller (Abbildung 1).
- Entfernen Sie die Abdeckung aus einer sterilen 24-Well-Platte. Platzieren einer 2 cm x 2 cm großes Stück Filterpapier in den Boden einer jeden der Vertiefungen. Überlagern die Platte mit einem Stück von 4 "x 7" Parafilm.
- Mit einem großen, rechteckigen Gegenstand, beispielsweise eine Mikropipettenspitze Box, reiben Sie die Parafilm auf den Brunnen, um den Parafilm an den gut Öffnungen perforiert und eine Abdichtung zu schaffen über den Rest der Platte. Entfernen Sie die Lochkreise Parafilm jetzt Abdecken der Brunnen. Die Platte sollte jetzt fest mit Parafilm in allen Bereichen abgedeckt werden außer dem gut openings.
- 10 min vor dem Ende der Inkubation werden 200 ul 3 N NaOH zu jeder Vertiefung der Filterpapierplatte, so dass das Filterpapier absorbiert die gesamte Flüssigkeit.
- Gegebenenfalls vor dem Einfrieren, Transfer des Mediums auf eine frische 24-Well-Platte. Nach einmaligem Waschen mit PBS, lysieren die restlichen Zellen in 0,1 N HCl und berechnen Proteingehalt durch BCA-Assay.
- Am Ende der Inkubation Schnappgefrierassayplatte in flüssigem Stickstoff. Seien Sie vorsichtig, um jede Vertiefung zu gewährleisten ist komplett eingefroren, bevor Sie fortfahren.
- 100 l 70% iger Perchlorsäure in jede Vertiefung der Testplatte. Unmittelbar decken mit dem Filter Pappteller. Legen Sie die Platten auf einem Orbitalschüttler und Felsen am Umlaufgeschwindigkeit von 80 rpm bei RT für 2 h.
- Nach der Inkubation der Proben zu verarbeiten:
- Um den CO 2 -Anteil zu messen, übertragen Sie die Filterpapier Quadrate, um 4 ml flüssige Szintillationsflüssigkeit in einem SzintillationszählerFläschchen und Maßnahme 14 C-Signal.
- Um den säurelöslichen Materials zu messen, zu übertragen 400 ul Medium in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10 min. 100 l des resultierenden Überstandes auf 500 ul von 2: 1 Chloroform-Methanol (v / v), und kurz vortexen.
- Fügen Sie 250 ul Wasser zu der Mischung und Wirbel erneut. Zentrifuge Proben für 10 min bei 3.000 x g. Transfer 200 ul der oberen Phase auf 4 ml flüssige Scintillationsflüssigkeit in einem Szintillationsfläschchen und messen 14 C-Signal.
4. Lipogenese-Assay
- Der Abend vor dem Test, waschen Sie die Zellen 2 mal mit warmem PBS. Ändern Sie die Hepatozyten, um Serumhungermedium mit 100 nM Insulin. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
Anmerkung: Da fötales Rinderserum enthält eine unbekannte Konzentration von Stoffwechsel Hormone (zB Insulin, Glucagon), Zu verhungern Serum die Zellen keine verwirrende Auswirkungen dies auf den Assay haben können, zu entfernen. Zellen lebensfähig in Serumhungermedium für> 24 h. Insulin wird in diesem Test verwendet werden, um die Lipogenese zu stimulieren. - Machen Lipogenese Medium: Serumhungermedium mit 100 nM Insulin, 10 & mgr; M kaltem Acetat und 0,5 & mgr; Ci 3 H-Acetat pro Vertiefung. Wechselzellen Lipogenese Medium und bei 37 ° C für 2 Std. Fügen Sie alle Verbindungen von Interesse getestet werden.
- Nach der Inkubationszeit, waschen Zellen 2 mal mit PBS. Lysieren Zellen durch Abschaben in 120 ul 0,1 N HCl. Reserve 10 & mgr; l für die Protein-Assay (Beurteilung durch BCA-Test), und Transfer 100 ul bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Extrakt Lipide durch Zugabe von 500 ul von 2: 1 Chloroform-Methanol (v / v). Vortex kurz und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 250 ul Wasser, Wirbel und Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 5 min. Centrifuge Proben 10 min bei 3.000 xg, RT. Sorgsamübertragen untere Phase bis 4 ml flüssige Szintillationsflüssigkeit in einem Szintillationsfläschchen und messen 3 H-Aktivität.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatozyten-Isolierungen führen in der Regel in 1-3 x 10 7 Zellen insgesamt. Nach Inkubation über Nacht werden die Zellen hexagonal, von denen viele binukleären werden (Figur 2) angezeigt werden. Gesunde Zellen sollten frei von Granulationen oder Blasen, was auf Zelltod sein.
Im allgemeinen wird die Oxidation von Fettsäuren Assays in drei bis vier Wiederholungen pro Testverbindung ausgeführt. Zählungen für die CO 2 Proben sind etwa ein Fünftel derjenigen des säurelöslichen Materials abgeleitet. Berechnet man typischerweise das Verhältnis von CO 2 zu säurelöslichen Materials als Maß für die vollständige Oxidation (das heißt, die Menge über den Zitronensäurezyklus oxidiert). Substanzen, die Zellatmung zu fördern, wie Carbonylcyanid-4- (trifluormethoxy) -phenylhydrazon (FCCP) wird dieses Verhältnis zur CO 2 zu verschieben, was weitere Oxidation durch den TCA-Zyklus. Inhibitoren der Atmungskette wird die Oxidation auf der gesamten vermindern(Abbildung 3). Wenn Pilotierung dieses Tests ist es am besten, um eine nicht-Zellkontrolle, um sicherzustellen, wird der Vorgang der Herstellung zellspezifische Aktivität schließen.
Die Lipogenese-Assay wird meist auf einen Null Zeitpunkt Kontrolle (Zellen mit Substrat unmittelbar vor der Ernte behandelt wurden) verglichen. Der Test sollte als Funktion der Zeit über zumindest vier Stunden Inkubation linear sein. Verbindungen, die die Oxidation von Fettsäuren zu erhöhen, wie FCCP oder ATP-Synthese zu verringern, wie oligomycin wird lipogene Aktivität (Figur 4) zu reduzieren.
Abbildung 1: Vorbereitung der Filterplatte an der Filterplatte vorzubereiten, wie in Schritt 3.6 beschrieben, entfernen Sie die Abdeckung aus einer sterilen 24-Well-Platte. Platzieren einer 2 cm x 2 cm großes Stück Filterpapier an der Basis jeder Vertiefung. Überlagern die gesamte Platte mit einem 7 "x 4" Stück paraFilm, und reiben Sie die Platte dicht versiegeln die Spitze der Brunnen. Dies wird perforierten Kreise Parafilm über die Vertiefungsöffnungen, die entfernt werden sollen generieren. Nach Zugabe der Perchlorsäure in Schritt 3.9, setzen Sie den Filter Pappteller dicht über der Testplatte, um eine Dichtung zu erzeugen.
Abbildung 2: primären Hepatozyten in Culture Phase Bildern von gesunden und ungesunden Primär Maushepatozyten Kontrast 16 Stunden nach der Plattierung in Kollagen beschichteten 24-Well-Platten. Maßstabsbalken, 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Fettsäureoxidation von Primär Maus-Hepatozyten in Kultur 14 C-Palmitate Oxidation zu (A) CO 2, (B) säurelöslichen Material und (C) das Verhältnis von CO 2 zu säurelöslichen Material von primären Hepatozyten mit Fahrzeugs FCCP oder oligomycin inkubiert. Daten sind Mittelwerte ± SEM. * p <0,05, ** p <0,01 vs. Fahrzeug durch einseitigen Student-t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Lipogenese in kultivierten primären Maushepatozyten (A) lipogenen Aktivität gegen die Zeit in primären Hepatozyten mit 3 H-Acetat und (B), lipogene Aktivität in Anwesenheit eines Fahrzeugs, Oligomycin oder FCCP behandelt. Daten sind Mittelwerte ± SEM. *** p <0,001 vs. Fahrzeug durch einseitigen Student-t-Test.
| Tabelle 1 | |||
| Kultur Medien | |||
| Plattierungsmedium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| FBS | 10% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Dexamethason | 1 & mgr; | ||
| Insulin | 0,1 & mgr; M | ||
| Wartung Medium | |||
| DMEM | 500 ml | BSA Fraktion V | 0,2% |
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Dexamethason | 0,1 & mgr; M | ||
| Insulin | 1 nM | ||
| Hungermedium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| BSA Fraktion V | 0,2% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Zeit vom Opfer Perfusion sollte weniger als 3 min für ideale Perfusion und Kollagenaseverdau der Leber. Sobald Perfusion mit Perfusionsmedium eingeleitet wird, sollte die Leber sofort Aussehen von rot bis hell ändern. Nach ca. 10 min Inkubation mit LDM, wird die Leber geschwollen und rosa angezeigt. Im Falle, dass die Perfusion unzureichend ist, kann die Leber nicht zeigen diese Änderungen, und dies wird in der Regel in einem unteren Hepatozyten Ausbeute führen.
Nach den Waschschritten isolierten Hepatozyten kann für mehrere Stunden in Suspension auf Eis vor dem Beschichten gelagert werden. Einmal überzogen, kultivierten Hepatozyten erfordern mehrere Stunden zu haften und sich auszubreiten. Nach 2 Stunden Inkubation in Plating Medium, werden die Leberzellen klein und rund bleibt. Nach Inkubation über Nacht, werden Leberzellen auf einer charakteristischen sechseckige Aussehen, von denen viele zweikerniger werden zu nehmen. Wenn die Zubereitung ist ungesund, die cEllen zahlreiche Körnungen und gelegentlichen Blasenbildung, was auf Zelltod aufweisen. Um Kulturlebensfähigkeit am besten erhalten, sollten Medien alle 24 Stunden gewechselt werden und darauf geachtet werden, die Exposition zu minimieren, um Luft zu öffnen.
Natriumpalmitat ist unlöslich in Wasser bei RT jedoch nach Inkubation bei 70 ° C ist es vollständig zu lösen sollte. Die Exposition gegenüber RT bewirkt, dass der Lipid schnell zu verfestigen, so ist es zwingend notwendig, schnell zu arbeiten. Sobald Palmitat in Vorinkubationsmedium gelöst worden ist, ist es wichtig, das Medium bei 37 ° C, um die Löslichkeit der Lipide zu halten aufrechtzuerhalten.
Wie oben erwähnt, um genaue Ergebnisse der Fettsäureoxidation Assay zu gewährleisten, muß das Medium in flüssigem Stickstoff vollständig gefroren ist. Dies verhindert ein Entweichen von CO 2 während der Zugabe von Perchlorsäure in die Vertiefungen. Unmittelbar nach der Zugabe der Perchlorsäure zu den gefrorenen Proben, muss der Testplatte dicht Cdurch den Filter Pappteller overed, achten Sie darauf, die Platten für die Gasübertragung zwischen den Vertiefungen auszurichten. Da das Filterpapier wird mit einem Überschuss von NaOH eingeweicht, ist die Stöchiometrie der Reaktion in der Lage, die Erfassung der Freigabe von CO 2 als NaHCO 3. Versuche nach diesem Protokoll sind reproduzierbare Ergebnisse erzeugt werden, mit typischen Wiederholungen mit% CV ≤ 10. Wenn nötig, säurelösliche Material aus der Fettsäureoxidation Assay oder dem Zelllysat von der Lipogenese-Assay geeignet ist, bei -80 ° C gelagert oder verarbeitet werden später ohne nennenswerte Auswirkungen auf die Ergebnisse. Die oben beschriebenen Tests ermöglichen eine relativ einfache und zeitspar Mechanismus zum Lipidstoffwechsel in primären Hepatozyten von Maus-Leber isoliert beurteilen. Durch Verwendung von ex vivo Kultur Diese Methoden erlauben die Prüfung der Auswirkungen der verschiedenen Bedingungen auf die Fettsäureoxidation und Lipogenese. Dieses Protokoll kann auch, die Rolle der genetischen Veränderungen auf diesen proce beurteilensses jedoch ist die Isolierung von Hepatozyten Zeitbegrenzung und somit in vivo Analysen besser geeignet für die Untersuchung bestimmter transgene Tiermodelle sein. Wenn die Analyse mehrerer Hepatozyten Präparate notwendig ist, kann die Normalisierung der Probenwerte, um Proteinspiegel, wie im wahlweisen Schritt 3.7.1 beschrieben, und für die Normalisierung verwendet durchgeführt werden. Wir empfehlen Assays in mehreren Präparaten durchgeführt, wie relative Veränderungen gegenüber einer geeigneten Kontrolle verglichen werden.
Schließlich haben wir nicht die Möglichkeit, längere Kulturzeiten untersucht jedoch Hepatozyten können gleichwertige metabolischen Eigenschaften nach mehreren Tagen in Kultur aufweisen. Mit geringfügigen Änderung, kann dieses Protokoll angepasst, um für mehrere Tage der Behandlungen vor der Beurteilung der Wirkungen von Verbindungen auf den Fettstoffwechsel zu ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquot and store at -20 °C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Collagen | Life Technologies | A1048301 | |
| Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillin / Streptomycin | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulin | Sigma | I0516-5ML | |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumin (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| Tygon S3 Tubing | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Male Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" Catheter | SurFlo | SROX2419CA | |
| Perma-Hand Silk Suture | Ethicon | 683G | |
| Cell Strainer | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath | Fisher | 13-874-3 | |
| MasterFlex C/L Peristaltic Pump | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilize in autoclave |
| 5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilize in autoclave |
| 24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilize in autoclave |
| 60 ml Syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50 ml conical tubes | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| Serological pipets | |||
| 1,000, 200, 20 μl pipet and tips |
References
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al. Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).
- Angulo, P.
- Adams, L. A., et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).
- Feldstein, A. E., et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).
- Day, C. P., James, O. F. Steatohepatitis: a tale of two 'hits'. Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).
- Donnelly, K. L., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).
- Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).
- Parks, E. J., Hellerstein, M. K. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).
- Befroy, D. E., et al. Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy. Nature medicine. 20, 98-102 (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malaria journal. 6, 169 (2007).
