Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
Die Atmung ist eine komplexe und Lebenstätigkeit vom Gehirn gesteuert, so dass Disauerstoff (O 2) Aufnahme und Kohlendioxid (CO 2) Beseitigung. Der zentraler Atemantrieb wird durch ein komplexes Netzwerk im Hirnstamm sowohl in Säugetieren als 1 liegt, Amphibien 2, Reptilien 3, 4 Vögel und Fische 5 generiert. Auch wenn die Untersuchung der Atmung kann in vivo verarbeitet werden, präzise mechanistische Untersuchungen erfordern einen direkten Zugang zu dem Atemsteuerungsnetz. Hierzu Adrian und Buytendijk entwickelt eine reduzierte Goldfischzubereitung, bei dem Elektroden auf der Hirnoberfläche aktenkundig den erzeugten Rhythmuskiemen Belüftung 5 verbunden. Dieser Ansatz wurde später von Suzue 1984 6 zur Verwendung bei neugeborenen Nagern angepasst. Das Aufkommen dieser Zubereitung zu erheblichen Fortschritten in der Atem Neurobiologie geführt. Da es relativ einfach ist, hat die Technik here zugänglich ist eine breite Palette von Grundlagenuntersuchungen der rhythmische motorische Verhaltensweisen und ihren Ursprung in der neugeborenen Nagern.
Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, das neuronale Korrelat inspiratorischen Aktivität aufzuzeichnen, eine Atemwegsartigen Rhythmus genannte fiktive Atmung, ausgelöst durch den Atem Netzwerk hergestellt. Dieses Verfahren kann in einem breiten Spektrum von Forschungsziele eingesetzt werden, Targeting Inspirations antwortet Atemschwankungen oder Pharmakologie in beiden Wildtyp 7 und 8 transgenen Tieren. Da die Versuche werden bei einer niedrigen Temperatur durchgeführt wird, ohne afferenten Neuronen, und unter Bedingungen, bei denen die Konzentrationen von Glucose und O 2 in der aCSF hoch sind Fragen aufgeworfen über die physiologische Bedeutung des aufgezeichneten Signals. Zwar gibt es deutliche Unterschiede zwischen den in-vivo- und in-vitro-Bedingungen (z. B. die Frequenz des inspiratorischen Bursts) bleibt die Tatsache, dass das Vorhandensein vondie Kernelemente der Atemnetz 6 ist es möglich, eine robuste Rhythmus zu einer lebenswichtigen homöostatischen Funktion 9,10 assoziiert zu studieren.
Das Grundprinzip hinter der Entwicklung und der Einsatz dieser Technik ist es, einen direkten Zugang zum Hirnstamm Elemente des Atem Netzwerk, das in vivo schwer zugänglich sind, insbesondere bei Neugeborenen zu erleichtern. Der Hirnstamm unter streng kontrollierten Bedingungen ausgesetzt: das aufgezeichnete Rhythmus nicht von peripheren afferenten Inputs der Lunge oder der Halsschlagkörpern moduliert, so dass die Untersuchung auf den zentralen Atemantrieb selbst 11 konzentrieren. Somit ist dieser Zugang genutzt, um Reize gelten und notieren Sie die Ausgangssignal. Im Gegensatz zu Aufzeichnungen Plethysmographie wird der Atemrhythmus durch alle ihre Komponenten im ganzen Körper moduliert (z. B. Lungendehnung, periphere Chemosensoren) und macht es schwierig, eine genaue Stimuli anzuwenden.
In einem (newborn Ratte, das Protokoll aus der Aufzeichnung der vierten ventralen Wurzel Signal auf einem isolierten Hirnstamm und ein verkürztes Rückenmark, in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) gehalten. Die von Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen erzeugten Rhythmus der einzelnen langsamen Bursts, die auf der Inspirationssignal 9 verknüpft sind. Isolated Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen sind leicht bei Ratten bespielbar von postnatalen Tag 0-4 (P0 – P4) 7. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die hypoxische Reaktion der Atem Netzwerk und auch die Antwort auf Hyperkapnie, Azidose oder Arzneimittel zu bewerten. Eine akute Hypoxie Protokoll wird hier vorgestellt. Diese Stimulation wird durch Entnahme von O 2 in der aCSF erhalten; Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die Toleranz und Ansprechbarkeit auf hypoxische Beleidigungen beurteilen. Das Protokoll verursacht eine Rhythmus Vertiefung von der ersten Minute, bis zum Ende der Belichtung Hypoxie (1) 12. Diese Vertiefung wird umgekehrtwährend der post-hypoxischen Recovery 12. Bezüglich der Versuchsanordnung ist es wichtig, zu bemerken, daß die Brücke, an der rostralen Teil der Hirnstamm, eine hemmende Wirkung auf den Rhythmusgenerator 8. So Zubereitungen der volle Hirnstamm und Rückenmark rostral zeigen eine geringere Rhythmus. Einbeziehung der Brücke in der isolierten Probe auf die Aufzeichnung wird entsprechend dem Ziel des Experiments 13 bestimmt wird; das Studium der pontine Einfluss auf das verlängerte Mark Netz erfordern würde Aufnahmen mit und ohne die Brücke, um die Ergebnisse 14 zu vergleichen. Außerdem ist einer der Vorteile dieser Technik die Möglichkeit einer Ausdehnung des rostralen Teil der Vorbereitung auf Mesencephalon-und / oder Zwischenhirnregionen 15,16 umfassen, die es ermöglicht, die Wirkung dieser Regionen auf dem ponto-medullären Atemnetz bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genaue Quantifizierung der Atmungsaktivität kann eine Herausforderung sein. In der Tat ist die Atmung eine Funktion, die automatische und freiwillig sein kann, und das ist entsprechend der Umgebung, die Bedürfnisse des Körpers, den emotionalen Zustand und das Verhalten moduliert. Der Vorteil dieser Technik ist die Isolierung von den neuronalen Elementen zur Erzeugung des Atembefehl verantwortlich. Somit elektrophysiologische Aufzeichnungen von Hirnstamm-Rückenmarkspräparaten und Plethysmographie komplementäre Tech…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
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