אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
נשימה היא פעילות מורכבת וחיונית הנשלטת על ידי המוח, המאפשרת dioxygen (O 2) ספיגה ופחמן דו חמצני (CO 2) חיסול. כונן הנשימה המרכזי מופק על ידי רשת מורכבת ממוקמת בגזע המוח בשני היונקים 1, דו-חיים 2, זוחלים 3, 4 ציפורים ודגים 5. גם אם המחקר של נשימה יכול להיות מעובד בvivo, חקירות מכניסטית מדויקות דורשות גישה ישירה לרשת שליטה בדרכי הנשימה. לשם כך, אדריאן וBuytendijk פיתחו הכנת דג זהב מופחתת, שבו אלקטרודות המונחת על משטח שיא גזע המוח קצב שנוצר קשור לאוורור זימים 5. גישה זו הותאמה לאחר מכן על ידי Suzue בשנת 1984 6 לשימוש במכרסמים שזה עתה נולד. כניסתו של תכשיר זה הובילה להתקדמות משמעותית בנוירוביולוגיה בדרכי הנשימה. מאז הוא פשוט יחסית, הטכניקה הציגה hבטרם ניתנים למגוון רחב של חקירות בסיסיות של התנהגויות מוטוריות קצביות ומקורותיהם במכרסמים שזה עתה נולד.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקליט את התשתית העצבית של פעילות שאיפה, קצב כמו-נשימה נקרא נשימה פיקטיבית, המיוצרת על ידי הרשת בדרכי הנשימה. שיטה זו יכולה להיות מועסק במגוון רחב של מטרות מחקר, מיקוד תגובות שאיפה לשינויים או פרמקולוגיה נשימה בסוג 7 ומהונדסים 8 שני חיות בר. בהתחשב בכך שהניסויים מבוצעים בטמפרטורה נמוכה, ללא afferents חושית, ובתנאים שבי הריכוזים של גלוקוז וO 2 בתוך aCSF גבוהים, שאלות הועלו לגבי הרלוונטיות הפיזיולוגיות של האות נרשמה. אמנם יש הבדלים ברורים בין in vivo ובתנאי מבחנה (למשל., התדירות של התפרצויות שאיפה) העובדה היא שהנוכחות שלמרכיבי הליבה של רשת הנשימה 6 לעשות את זה אפשרי ללמוד מקצב חזק הקשורים לתפקוד homeostatic חיוני 9,10.
הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו הוא להקל על גישה ישירה לאלמנטי גזע המוח של הרשת בדרכי הנשימה, שהם כמעט ולא נגישים in vivo, במיוחד בתינוקות. גזע המוח ממוקם בתנאים מבוקרים בקפדנות: קצב שנרשם לא מווסת על ידי תשומות מביא היקפיים מהריאות או גופי התרדמה, המאפשר המחקר להתמקד בכונן הנשימה המרכזי עצמו 11. לפיכך, גישה זו מנוצלת ליישם גירויים ולהקליט את אות הפלט. בניגוד לplethysmography הקלטות, קצב הנשימה הוא מווסת על ידי כל מרכיביו בכל הגוף (לדוגמא., התנפחות ריאות, chemosensors ההיקפי), ולכן קשה ליישם גירויים מדויקים.
בעכברוש ewborn, הפרוטוקול מורכב מהקלטת האות הרביעית הגחון שורש בגזע מוח מבודד וחוט השדרה קטוע, נשמר בנוזל מלאכותי Cerebro-השדרה (aCSF). קצב שנוצר על ידי הכנות כבל גזע המוח-השדרה מורכב מהתפרצויות איטיות בודדות שצמודות לאות השאיפה 9. הכנות כבל גזע המוח-השדרה מבודדות בקלות לצריבה בחולדות מיום שלאחר הלידה 0-4 (P0 – P4) 7. גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את תגובת חוסר חמצן של רשת דרכי הנשימה, וגם התגובה לhypercapnia, חמצת או סמים. פרוטוקול היפוקסיה חריף מוצג כאן. גירוי זה מתקבל על ידי נסיגה של O 2 בaCSF; גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את הסובלנות והיענות לעלבונות חוסר חמצן. הפרוטוקול גורם דיכאון קצב מהרגע הראשון ועד לסוף חשיפת היפוקסיה (איור 1) 12. דיכאון זה מתהפךבמהלך 12 התאוששות לאחר חוסר חמצן. בנוגע לעיצוב ניסיוני, חשוב לשים לב שפונס, הממוקם בחלקו מקורי של גזע המוח, יש פעולה מעכבת על הגנרטור קצב 8. כך, הכנות של גזע המוח וחוט השדרה מלאים מקורי להציג קצב נמוך יותר. הכללה של פונס במדגם המבודד להקלטה נקבעה בהתאם למטרת הניסוי 13; המחקר של השפעת פונטיני ברשת הלשד המוארכת ידרוש הקלטות עם ובלי פונס להשוות את התוצאות 14. יתר על כן, אחד היתרונות של שיטה זו היא האפשרות להארכת החלק מקורי של ההכנה לכולל mesencephalic ו / או אזורי diencephalic 15,16, כך שניתן להעריך את ההשפעה של אזורים אלה ברשת הנשימה פונטו-לשדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כימות מדויק של פעילות נשימה יכול להיות מאתגר. ואכן, נשימה היא פונקציה שיכולה להיות גם אוטומטי ורצון, וכי הוא מווסת בהתאם לסביבה, הצרכים של הגוף, המצב הרגשי וההתנהגות. היתרון של שיטה זו הוא הבידוד של האלמנטים העצביים האחראים לייצור את פקודת דרכי הנשימה. לפיכך, קלטות אלק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neurosciences. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neurosciences. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
