微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em>インビトロ</em>実験モデル
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
微小電極アレイ（MEAの）に結合された試験管 2次元（2D）のニューラルネットワークではニューロンのダイナミクスと基礎接続の間の相互作用を研究するために採用した金標準実験モデルをarethe。開発中に、ニューロンは、よくdefinedspatio-temporalpatternsof活性を示す複雑なネットワーク1,2（ すなわち 、バースト、ネットワークバースト、ランダムスパイク活動を）再作成します。 MEAがネットワークレベルで発現ダイナミクスの詳細な調査を可能にする、多くのサイトから（数十から数千の微小電極に）電気生理学的活動を記録。また、解離文化の使用は、設計、ネットワークを設計することが可能ですになります。これは、異種の神経ポップの存在、このように記録された電気生理学的活性および細胞密度3、モジュール4,5度のようなネットワーク組織のパラメータとの間の機能の関係を理解することは容易ですulations 6などがしかし、解離培養細胞上のすべてのin vitroでの研究は、2D神経回路網に基づいています。このアプローチは 、in vivo（本質的に3次元、3D）システムに関してoversimplificationsにつながる：2Dモデル、細胞体と成長円錐（I）における平坦化され、軸索、樹状突起の伸長は、全方向7に拡散することはできません。 （ii）の2D インビトロネットワークの展示は、ネットワーク8のニューロンの大部分を伴う活動を破裂によって支配電気生理学的ダイナミクスをステレオタイプ。
最近、 インビトロの3次元構造を可能にするために開発されてきた別の解決法は、神経ネットワークを解離しました。一般的な考え方は、ニューロンが、3Dの方式で成長することができます足場を作ることにあります。そのような足場は、高分子ゲル、固体多孔質マトリックス9-13で実現することができます。ポリマーの機械的性質を利用することにより、THES細胞内を埋め込むことが可能ですニューロスフェア11の3次元培養の均一なブロックを定義することにより、電子構造。このアプローチの主な特徴は、神経球9,12の剛性機械的性質です。しかしながら、これらの材料は、多孔性が制限されており、それらは、マトリックス内部の細胞移動を保証しません。この欠点を克服するために、可能な解決策は、「ユニット」モジュールにマトリクスをスライスすることからなります。残念ながら、粒子のサイズおよび形状の多様性は、通常、層状構造への充填を妨げる可能性があります。 7では 、カレンと共同研究者は、生物活性、細胞外マトリックスベースの足場内のニューロンおよび/ またはアストロサイトで構成された3D神経構造物を設計しました。このような操作された神経組織は、3Dマイクロ環境内の神経生物学的応答を研究し、操作するためにインビトロの研究では許可 。このモデルでは、細胞外マトリックス（ECM）および/またはヒドロゲル足場（500-600ミクロン厚）全体に分散ニューロンおよびグリア細胞から成っていました。この共同で5,000細胞/ mm 3 – ndition、最適な細胞生存率（90％より大きい）が約3750の最終密度で細胞をプレーティングすることによって発見されました。そのような濃度値がマウスの脳皮質の細胞密度が90,000細胞/ mm 3 14でのin vivo条件でのものよりもはるかに低いことに留意しなければなりません。この制限を克服し、Pautot 15は、細胞密度とのネットワーク接続は、ネットワークのリアルタイムイメージングを可能にしながら、インビボ条件に似ているように制御される三次元インビトロシステムを実現するために、同僚。実際に、この方法は、培養神経細胞は、 シリカマイクロビーズ上で増殖することができる解離概念に基づいています。これらのビーズは付着する神経細胞体のためと、成熟した、成長し拡張し、他のニューロンへのシナプスの連絡先を定義するために、彼らのarborizationsための十分な大きさの成長表面を提供します。この方法は、FOする単分散ビーズの自発的な組立特性を利用RM 3Dは、異なるビーズ上のニューロンの間で拘束された接続性を有する異なる層のニューロンの明確なサブセットを含む六角形の配列をレイヤード。この方法で達成された細胞密度は約75,000細胞/ mm 3でした 。
最近、我々は、MEAを16にPautotの方法を適応している。得られた結果は、3D電気生理学的活性は、2Dネットワークによって発現される1以上の活動の広いレパートリーを提示することを示しています。 3D成熟した文化がネットワークバーストと、ランダムなスパイク活動の共存の両方強化ダイナミックを示します。同様に、唐-Schomerと同僚17は、数ヶ月のために、in vitroでの一次皮質培養を維持シルクプロテイン系の多孔質足場を実現し、タングステン電極を用いて電気生理学的活性を記録しました。
この作品では、多国間環境協定に結合された3次元神経回路網を構築するための実験手順を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この作品では、3Dで構成された試験管プラ ットフォームにおける新規の実験では、ネットワークの電気生理学のためのMEAに結合された神経細胞培養は、提示された設計しました。 Z -軸に沿って神経突起伸長を可能にするための足場としてのマイクロビーズの使用は、平面MEAと統合するように調整されています。このように、有効かつ信頼性の高いin vitroでの3D?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、閉じ込め構造とdottの開発に技術的なサポートのためにジョルジオCarliniに感謝します。原稿の徹底した見直しのためのオルネラLoBrutto。これらの結果につながる研究は、欧州連合（EU）の7 番目のフレームワークプログラムから資金提供を受けた（ICT-FET FP7 / 2007年から2013年、FETヤング探検方式）付与契約284772脳弓下（www.brainbowproject.eu）。
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
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