마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em> 체외</em> 실험 모델
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
마이크로 전극 배열 (다자간)에 결합 된 생체 외 2 차원 신경망에서 신경 역학과 기본 연결 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 채택 금 표준 실험 모델을 arethe. 개발하는 동안, 신경이 잘 표시 복잡한 네트워크를 다시 definedspatio-temporalpatternsof 활동 1, 2 (즉, 버스트, 네트워크 버스트, 임의의 급상승 활동). MEA의 네트워크 레벨에서 표현의 상세한 역학 조사를 허용 많은 위치에서 (수십 마이크로 전극으로부터 수천) 전기 생리 활성을 기록한다. 또한, 해리 배양의 사용은 설계 – 네트워크를 설계 할 possibile 만든다. 이것은 이런 식으로 이해하기 쉽게 기록 전기 생리 활성 간의 기능적 관계 및 셀 밀도 3, 4, 5의 모듈화 정도, 이종 신경 팝의 존재 등의 네트워크 조직의 파라미터등 ulations 6 그러나, 배양 된 세포에 해리 된 모든 시험 관내 시험은 2D 신경 네트워크에 기초한다. (7) 모든 방향으로 확대 할 수 평탄화되어 2D 모델 인 somata 성장 콘 (I) 및 축색 돌기 – 생장이 방법은 생체 내 (본질적으로 3 차원, 3D) 시스템에 대해 oversimplifications 리드. (II) 2D 체외 네트워크 전시는 네트워크 (8)의 신경 세포의 대부분을 포함하는 활동을 파열에 의해 지배 전기 생리 역학에 박힌.
최근, 다른 솔루션은 3D는 신경 네트워크를 해리 체외의 구성을 허용하도록 개발되었다. 일반적인 생각은 신경 세포는 3D 방식으로 성장할 수있는 발판을 만드는 구성되어 있습니다. 이러한 지지체는 고분자 겔 및 고체 다공성 매트릭스 9-13로 실현 될 수있다. 중합체의 기계적 특성을 이용함으로써, 내부 살전 세포를 포함 할 수있다neurosphere를 11의 3D 문화의 균일 한 블록을 정의하여 전자 구조. 이 방법의 주요 특징은 neurosphere를 9,12-의 강성, 기계적 특성이다. 그러나, 이들 물질은 기공률이 제한되어, 그들은 매트릭스 내부 세포 이동을 보장하지 않는다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 가능한 해결책은 '단위'모듈로 매트릭스를 슬라이스로 구성되어 있습니다. 불행히도, 입자의 크기 및 형상은 다양 정규 층상 구조로 포장을 방해 할 수있다. 7에서 컬린과 동료 생리 활성 세포 외 기질 기반의 발판 내에서 뉴런 및 / 또는 성상 세포로 이루어진 3 차원의 연결 구조를 설계했다. 이러한 설계 신경 조직은 3 차원 미세 환경 내에서 신경 생물학적 반응을 연구하고 조작하는 체외 조사에있었습니다. 이 모델은 세포 외 기질 (ECM) 및 / 또는 하이드로 겔 지지체 (500-600 μm의 두께)에 걸쳐 분산 뉴런 및 아교 세포로 구성되었다. 이 공동으로/ mm 3 5,000 세포 – ndition, 최적의 세포 생존율 (90 % 이상)은 약 3,750의 최종 밀도로 세포를 플레이 팅에 의해 발견되었다. 그러한 밀도 값은 마우스 뇌 피질의 세포 밀도는 약 90,000 세포 / 14 mm 3 인 생체 조건에서 하나보다 훨씬 낮다는 것을 주목해야한다. 이러한 제한을 극복 Pautot 15은 셀 밀도와 네트워크 연결이 네트워크의 실시간 영상을 가능하게하면서 생체 조건에서 비슷하게 제어되는 3D 관내 시스템을 실현 동료에게. 실제로,이 방법은 배양 된 신경 세포는 실리카 마이크로 비드에 성장 할 수있는 해리 개념을 기반으로합니다. 이 구슬을 준수하는 신경 세포 기관 및 성숙, 성장, 확장, 다른 뉴런 시냅스 연락처를 정의하는 그들의 arborizations만큼 큰 성장 표면을 제공한다. 이 방법은 FO하는 단 분산 비드의 자발적인 조립 성질을 이용RM 차원이 다른 구슬에 신경 세포 사이의 제한된 연결과 다른 층에 신경 세포의 고유 한 하위 집합을 포함하는 육각형 배열을 계층. 이 방법으로 달성 세포 밀도는 / mm 3 약 75,000 세포이었다.
최근에, 우리는 다자간 16 Pautot의 방법을 적응 : 얻어진 결과는 3D 전기 생리 활동이 2D 네트워크에 의해 표현 된 것보다 활동의 폭 넓은 레퍼토리를 제시 것으로 나타났다. 3D 성숙한 문화가 향상된 동적을 전시하는 네트워크 버스트 임의 스파이크 활동이 공존하는 모두. 마찬가지로, 탕-Schomer 동료 17 개월 일부 체외에서 일차 피질 배양을 유지 실크 프로테인 계 다공성 지지체를 실현하고, 텅스텐 전극에 의해 전기 생리 활성을 기록했다.
이 연구에서, 실험 절차는 MEA를 결합 3D 신경 네트워크를 구축하는 것이 설명 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 3 차원으로 구성 체외 플랫폼에서 새로운 실험 네트워크 전기 생리학에 대한 다자간가 제시되었다 결합의 연결을 문화를 설계. Z 방향을 따라 이동시킴으로써 행한다 신경 염성 생장을 허용하는 지지체로서 마이크로 비드의 사용은 평면 MEA와 일체화되도록 맞추어왔다. 이러한 방식으로, 유효하고 신뢰성있는 시험 관내 3D 모델에서 얻어진 마이크로 시스템 결과…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감금 구조와 dott 개발 기술 지원 조르지오 Carlini 감사합니다. 원고의 철저한 개정 ORNELLA LoBrutto. 이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램에서 자금을받은 (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET 젊은 탐험가 계획) 보조금 협정 284772 뇌 활에서 (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
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