Sammenknytning 3D Engineered neuronkulturer til Micro-elektrode Arrays: Et innovativt<em> In vitro</em> Forsøgsmodel
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro todimensionale (2D) neurale netværk koblet til Micro-elektrode Arrays (MEA) arethe guld-standard forsøgsmodel vedtaget for at studere samspillet mellem neuronale dynamik og den underliggende tilslutningsmuligheder. Under udviklingen, neuroner genskabe komplekse netværk, der viser godt definedspatio-temporalpatternsof aktivitet 1,2 (dvs. brister, netværk brister, tilfældig spiking aktivitet). MEA registrere elektrofysiologiske aktivitet fra mange steder (fra ti til flere tusinde mikroelektroder), så en detaljeret undersøgelse af de udtrykte dynamik på nettet niveau. Hertil kommer, at anvendelsen af dissocierede kulturer gør possibile at designe manipuleret-netværk. Det er lettere at forstå på denne måde de funktionelle relationer mellem den indspillede elektrofysiologisk aktivitet og parametrene for netværket organisation som celledensitet 3, grad af modularitet 4,5, tilstedeværelsen af heterogene neuronal popgørelser 6, osv Men alle in vitro-undersøgelser af dissocierede dyrkede celler baseret på 2D neuronale netværk. Denne metode fører til overforenklinger med hensyn til (3D uløseligt 3-dimensional) systemet in vivo: (I) i en 2D model, somata og vækstkegler er fladtrykte og axoner-dendritter udvækst kan ikke spredes i alle retninger 7. (ii) 2D in vitro netværk udviser stereotype elektrofysiologiske dynamik domineret af sprængning aktivitet, der involverer de fleste af neuronerne i netværket 8.
For nylig er forskellige løsninger blevet udviklet for at muliggøre konstruktionen af in vitro 3D dissocierede neuronale netværk. Den almindelige opfattelse består i at skabe et stillads, hvor neuroner kan vokse i et 3D mode. En sådan et stillads kan realiseres med polymergeler og faste porøse matrixer 9-13. Ved at udnytte de mekaniske egenskaber af polymererne, er det muligt at indlejre celler inde THESe strukturer ved at definere en ensartet blok af 3D-kulturer af neurosfærer 11. Det vigtigste træk ved denne tilgang er den stive mekaniske ejendom neurosfærer 9,12. Imidlertid har disse materialer begrænset porøsitet, og de garanterer ikke cellemigration inde i matrixen. For at overvinde denne ulempe, en mulig løsning består i at skære matricen i »enhed« moduler. Desværre kunne størrelsen og formen mangfoldighed af partiklerne hæmmer pakning i regelmæssige lagdelte strukturer. I 7, Cullen et al designet en 3D neuronal konstruktion består af neuroner og / eller astrocytter inden for en bioaktiv ekstracellulær matrix-baseret stilladset. En sådan konstrueret neuralt væv tilladt i vitro undersøgelser for at studere og manipulere neurobiologiske reaktioner inden 3D mikro-miljøer. Denne model bestod af neuroner og glia fordelt i den ekstracellulære matrix (ECM) og / eller hydrogel stilladser (500-600 um). I denne condition, en optimal cellelevedygtighed (større end 90%) blev fundet ved udpladning celler ved en endelig tæthed på ca. 3.750 – 5.000 celler / mm3. Det skal bemærkes, at en sådan densitet værdi er langt lavere end den i in vivo-tilstand, hvor celledensiteten af musen hjernecortex er omkring 90.000 celler / mm3 14. For at overvinde denne begrænsning Pautot og medarbejdere 15 realiseret en 3D in vitro system, hvor celledensiteten og netværksforbindelse styres til at ligne in vivo betingelser samtidig med at imaging i realtid af nettet. I praksis er denne metode baseret på det koncept, at dissocierede dyrkede neuroner er i stand til at vokse på silica mikrokugler. Disse perler giver en vækst overflade stor nok til neuronale celle organer til at overholde og for deres arborizations at vokse, modne, udvide, og definerer synaptiske kontakter til andre neuroner. Denne metode udnytter spontane forsamling egenskaber af mono-spredte perler til at foRM 3D lagdelte sekskantede arrays indeholder særskilte undergrupper af neuroner på forskellige lag med indsnævret tilslutning blandt neuroner på forskellige perler. Den opnåede celledensitet med denne metode var omkring 75.000 celler / mm3.
Vi har for nylig tilpasset Pautot metode til MEA 16: de opnåede resultater viser, at 3D elektrofysiologiske aktivitet viser et bredere repertoire af aktiviteter end den udtrykkes af 2D netværk. 3D modne kulturer udviser en forbedret dynamik, hvor både netværk burst og tilfældige spike aktivitet sameksistere. Tilsvarende Tang-Schomer og medarbejdere 17 realiseret en silke proteinbaseret stillads porøst, som opretholder en primær kortikal kultur in vitro i nogle måneder og registreres den elektrofysiologiske aktivitet ved hjælp af en wolfram elektrode.
I dette arbejde, at de eksperimentelle procedurer opbygge 3D neuronale netværk koblet til MEA vil blive beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde, en roman eksperimentel in vitro-platform består af 3D manipuleret neuronale kulturer koblet til multilaterale miljøaftaler for netværk elektrofysiologi er blevet præsenteret. Anvendelsen af mikroperler som stillads for at tillade neuritiske udvækst langs z-aksen er skræddersyet til at blive integreret med den plane MEA. På denne måde at de opnåede mikro-system resulterer i en gyldig og pålidelig in vitro-3D-model studere emergente elektrofysiologiske dynamik 16….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Giorgio Carlini for den tekniske support i udviklingen af indespærring struktur og DOTT. Ornella LoBrutto for gennemgribende revision af manuskriptet. Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra Den Europæiske Unions 7. rammeprogram (ikt-FET FP7 / 2007-2013 FET Young Explorers ordning) under tilskudsaftale 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
