Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em> In Vitro</em> Experimental Model
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro tweedimensionale (2D) neurale netwerken gekoppeld aan micro-elektrode arrays (MEA) arethe gouden standaard aangenomen om de wisselwerking tussen neuronale dynamiek en de onderliggende connectiviteit bestuderen experimenteel model. Tijdens de ontwikkeling, de neuronen recreëren complexe netwerken die goed weergegeven definedspatio-temporalpatternsof activiteit 1,2 (dat wil zeggen, uitbarstingen, netwerk uitbarstingen, willekeurige spiking activiteit). MEA registreren de elektrofysiologische activiteit van vele sites (van tientallen tot duizenden micro-electroden), waardoor een grondig onderzoek van de expressie dynamiek op netwerkniveau. Bovendien, het gebruik van gedissocieerde kweken maakt possibile engineered-netwerken te ontwerpen. Het is gemakkelijker te begrijpen op deze wijze de functionele verbanden tussen de opgenomen elektrofysiologische activiteit en de parameters van het netwerk organisatie als celdichtheid 3, modulariteit 4,5, aanwezigheid van heterogene neuronale populations 6, etc. Echter, alle in vitro naar gescheiden gekweekte cellen op basis van 2D-neuronale netwerken. Deze benadering leidt tot vereenvoudigingen ten opzichte van de in vivo (intrinsiek 3-dimensionale, 3D) systeem: (i) in een 2D-model, somata en groei kegels afgevlakt en de axonen-dendrieten uitgroei kan verspreiden in alle richtingen 7. (ii) 2D in vitro netwerken vertonen stereotiep elektrofysiologische dynamiek gedomineerd door barsten activiteit die het grootste deel van de neuronen van het netwerk 8.
Recentelijk zijn verschillende oplossingen ontwikkeld om de constructie van in vitro 3D gedissocieerde neuronale netwerken mogelijk maken. Het gemeenschappelijke idee bestaat in het creëren van een steiger waar de neuronen kunnen groeien in een 3D-mode. Een dergelijke steiger kan worden gerealiseerd met polymeer gels en vaste poreuze matrices 9-13. Door het benutten van de mechanische eigenschappen van de polymeren, is het mogelijk om cellen in te bedden these structuren door het definiëren van een uniform blok 3D culturen van neurosferen 11. Het belangrijkste kenmerk van deze aanpak is de starre mechanische eigenschap van de neurosferen 9,12. Echter, deze materialen beperkt porositeit, en dat doen ze niet garanderen celmigratie in de matrix. Om dit nadeel te ondervangen, een mogelijke oplossing bestaat uit het doorsnijden van de matrix in "eenheid" modules. Helaas, kunnen de grootte en vorm diversiteit van de deeltjes de pakking in reguliere gelaagde structuren belemmeren. In 7, Cullen en medewerkers ontworpen 3D neuronale construct uit neuronen en / of astrocyten binnen een bioactief extracellulair matrix-gebaseerde scaffold. Een dergelijke gemanipuleerde zenuwweefsel toegestaan in vitro onderzoek te bestuderen en te manipuleren neurobiologische reacties binnen 3D micro-omgevingen. Dit model bestaat uit neuronen en glia gedistribueerd door de extracellulaire matrix (ECM) en / of hydrogel scaffolds (500-600 micrometer dik). In dit condition een optimale cellevensvatbaarheid (meer dan 90%) werd gevonden door uitplaten cellen bij een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 3750 – 5000 cellen / mm3. Opgemerkt zij dat een dergelijke dichtheidswaarde veel lager dan in de in vivo toestand, wanneer de celdichtheid van muizenhersenen cortex ongeveer 90.000 cellen / mm 3 14. Om deze beperking te overwinnen Pautot en medewerkers 15 realiseerde een 3D in vitro systeem waarbij de celdichtheid en netwerkconnectiviteit gecontroleerd te lijken in vivo omstandigheden tegelijk een real-time weergave van het netwerk. Praktisch is deze methode gebaseerd op het concept dat gedissocieerde gekweekte neuronen kunnen groeien op silica microkorrels. Deze kralen te groeioppervlak groot genoeg voor neuronale cellichamen te houden en hun arborizations groeien, rijpen, uitbreiden en definiëren synaptische contacten met andere neuronen. Deze methode maakt het spontane samenstel eigenschappen van mono-gedispergeerde kralen FOrm 3D gelaagde zeshoekige arrays met verschillende subsets van neuronen op verschillende lagen met constrained verbinding tussen neuronen van verschillende kralen. De bereikte celdichtheid met deze methode ongeveer 75.000 cellen / mm3.
Onlangs hebben we methode Pautot's aangepast MEA 16: de verkregen resultaten blijkt dat de 3D elektrofysiologische activiteit presenteert een breder repertoire activiteiten dan het door 2D maken zich. 3D volwassen culturen vertonen een verbeterde dynamiek waarin zowel het netwerk burst en willekeurige spike activiteit naast elkaar bestaan. Evenzo Tang-Schomer en 17 medewerkers realiseerde een zijde eiwit-gebaseerde poreuze scaffold die een primaire corticale kweken handhaaft in vitro enkele maanden, en nam de elektrofysiologische activiteit middels een wolfraamelektrode.
In dit werk, de experimentele procedures 3D neuronale netwerken gekoppeld aan MEA bouwen wordt beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk, een nieuw experimenteel in vitro platform opgebouwd uit 3D-engineered neuronale culturen gekoppeld aan MMO's voor netwerk-elektrofysiologie is gepresenteerd. Het gebruik van microbolletjes als scaffold de neuritische uitgroei langs de z-as toe is afgestemd worden geïntegreerd met de vlakke MEA. Op deze wijze verkregen micro-systeem resulteert in een valide en betrouwbare in vitro 3D model voor de opkomende elektrofysiologische dynamiek 16 bestuderen.
<p class="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Giorgio Carlini voor de technische ondersteuning bij de ontwikkeling van de opsluiting structuur en Dott. Ornella LoBrutto voor de grondige herziening van het manuscript. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering van 7e kaderprogramma van de Europese Unie ontvangen (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers regeling) onder subsidieovereenkomst 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
