Grensesnitt 3D Engineered Nevronale kulturer til Micro-elektrode Arrays Et nyskapende<em> In Vitro</em> Experimental Model
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro-to-dimensjonale (2D) nevrale nettverk koblet til Micro-elektrode Arrays (måle) arethe gull-standard forsøksmodell vedtatt å studere samspillet mellom nerve dynamikk og den underliggende tilkobling. Under utviklingen, nevroner gjenskape komplekse nettverk som viser godt definedspatio-temporalpatternsof aktivitet 1,2 (dvs. bursts, nettverks bursts, tilfeldig spiking aktivitet). MEAs registrere elektrofysiologisk aktivitet fra mange steder (fra titalls til tusenvis av mikroelektroder), slik at en detaljert undersøkelse av de uttrykte dynamikken på nettverksnivå. I tillegg, gjør bruken av dissosierte kulturer possibile å utforme konstruerte-nettverk. Det er lettere å forstå på denne måten de funksjonelle forhold mellom det innspilte elektrofysiologisk aktivitet, og parametrene i nettverket organisasjon som celletettheten 3, grad av modularitet 4,5, nærvær av heterogene neuronal popskrifter 6, etc. Men alle in vitro-studier på dissosierte dyrkede celler er basert på 2D nevrale nettverk. Denne tilnærmingen fører til forenklinger med hensyn til in vivo (egentlig tre-dimensjonale, 3D) system: (i) i et 2D-modell, somata og vekst kjegler er flate og aksoner-dendritter utvekst kan ikke spre seg i alle retninger 7. (ii) 2D in vitro-nettverk oppviser konvensjonelektrodynamikk dominert av sprengning aktivitet som involverer de fleste av nevronene i nettverket 8.
Nylig har forskjellige løsninger blitt utviklet for å tillate bygging av in vitro 3D dissosiert nevrale nettverk. Den felles idé består i å skape et stillas der nerveceller kan vokse i et 3D mote. Et slikt stillas kan realiseres med polymergeler og solide porøse matriser 9-13. Ved å utnytte de mekaniske egenskaper av polymerer, er det mulig å legge inn celler inne these konstruksjoner med å definere en enhetlig blokk med 3D kulturer av neurosfærer 11. Den viktigste funksjonen i denne tilnærmingen er den stive mekaniske eiendom neurosfærene 9,12. Imidlertid har disse materialene begrenset porøsitet, og de garanterer ikke cellevandring inne i matrisen. For å overvinne denne ulempen, består en mulig løsning i slicing matrisen til andels 'moduler. Dessverre, kan størrelsen og formen mangfold av partiklene hindrer pakningen i regelmessige lagdelte strukturer. I 7, Cullen og medarbeidere utformet en 3D neuronal konstruksjon består av nevroner og / eller astrocytter innenfor et bioaktivt ekstracellulære matriks-baserte stillaset. En slik konstruert nervevev tillatt i vitro undersøkelser for å studere og manipulere nevrobiologiske svar innen 3D mikromiljøer. Modellen besto av neuroner og glia fordelt over hele den ekstracellulære matriks (ECM) og / eller hydrogel stillas (500-600 um tykk). I dette samarbeidetndition, en optimal celle-levedyktighet (større enn 90%) ble funnet ved utsåing av cellene i en endelig tetthet på omkring 3750 – 5000 celler / mm3. Det må bemerkes at en slik tetthetsverdi er langt lavere enn den i den in vivo tilstand, hvor celletettheten av musen hjernebarken er omtrent 90 000 celler / mm 3 14. For å overvinne denne begrensningen Pautot og medarbeidere 15 realisert en 3D-in vitro-system hvor celletetthet, og nettverkstilkoblingen blir styrt for å ligne in vivo forhold, samtidig som muliggjør sanntids avbildning av nettverket. I praksis er denne metoden basert på konseptet at dissosiert dyrkede nerveceller er i stand til å vokse på silika mikrokuler. Disse perlene gir en vekst overflate stort nok for nervecellelegemer til følge og for sine arborizations å vokse, modne, strekker seg, og definerer synaptiske kontakter til andre nerveceller. Denne metoden utnytter spontane monterings egenskapene til mono-spredt perler å form 3D lagvis sekskantede arrays som inneholder forskjellige undergrupper av nevroner på forskjellige lag med anstrengt tilkobling mellom nevroner på forskjellige perler. Den oppnådde celletetthet med denne fremgangsmåten var omtrent 75 000 celler / mm3.
Nylig har vi tilpasset Pautot metode i Meas 16: de oppnådde resultater viser at 3D-elektrofysiologisk aktivitet gir en bredere repertoar av aktiviteter enn den som er uttrykt ved 2D-nettverk. 3D modne kulturer viser en forbedret dynamisk der både nettverk burst og tilfeldig spike aktivitet eksistere. Tilsvarende Tang-Schomer og medarbeidere 17 realisert en silkeproteinbasert porøs stillas som opprettholder en primær kortikalt kultur in vitro for noen måneder, og tatt opp den elektrofysiologiske aktivitet ved hjelp av en wolframelektrode.
I dette arbeidet, til de eksperimentelle prosedyrer bygge 3D nevrale nettverk koplet i Meas vil bli beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet, en roman eksperimentell in vitro-plattformen består av 3D konstruert nevrale kulturer koblet til MEAs for nettverkselektrofysiologi har blitt presentert. Bruken av mikroperler som stillas for å tillate neuritic utvekst langs z -aksen er skreddersydd for å bli integrert med planar MEA. På denne måten, til de oppnådde mikro systemet resulterer i en gyldig og pålitelig in vitro 3D-modellen studere emergent elektrodynamikk 16.
MEA op…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Giorgio Carlini for teknisk støtte i utviklingen av innesperring struktur og dott. Ornella LoBrutto for grundig revisjon av manuskriptet. Forskningen som fører til disse resultatene har fått midler fra EUs 7. rammeprogram (IKT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers ordning) under tilskuddsavtalen 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
References
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
