Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em> In Vitro</em> Modelo Experimental
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
Em bidimensionais redes neurais (2D) vitro acoplados a Micro-Arrays eletrodo (AMA) arethe modelo experimental padrão-ouro adotada para estudar a interação entre a dinâmica neuronal e a conectividade subjacente. Durante o desenvolvimento, os neurônios recriar redes complexas que mostrar bem actividade definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (ou seja, explosões, rajadas de rede, atividade spiking aleatório). AAM registrar a atividade eletrofisiológica de muitos sites (de dezenas a milhares de microeletrodos), permitindo uma investigação detalhada da dinâmica expressos no nível da rede. Além disso, a utilização de culturas dissociadas faz possibile para conceber-redes modificadas. É mais fácil de entender, desta forma as relações funcionais entre a atividade eletrofisiológica registradas e os parâmetros da organização em rede como densidade de células 3, grau de modularidade 4,5, presença de pop neuronal heterogêneoulations 6, etc. No entanto, todos os estudos in vitro em células cultivadas dissociados são baseados em redes neuronais 2D. Esta abordagem conduz a simplificações em relação à (, intrinsecamente 3-dimensional 3D) Sistema in vivo: (I) num modelo em 2D, somata e cones de crescimento se encontram achatados e a excrescência axónios-dendrites não pode propagar em todas as direcções 7. (ii) 2D in vitro redes exposição estereotipada dinâmica eletrofisiológicos dominadas por atividade envolvendo a maior parte dos neurônios da rede 8 estourando.
Recentemente, soluções diferentes têm sido desenvolvidos para permitir que a construção in vitro de 3D redes neuronais dissociadas. A idéia comum consiste na criação de um andaime onde os neurônios pode crescer de uma forma 3D. Um tal andaime pode ser realizada com géis de polímeros e matrizes sólidas porosas 9-13. Ao explorar as propriedades mecânicas dos polímeros, é possível incorporar no interior das células Tse estruturas através da definição de um bloco uniforme de culturas 3D de neurospheres 11. A principal característica dessa abordagem é a propriedade mecânica rígida das neuroesferas 9,12. No entanto, estes materiais têm porosidade limitada, e eles não garantem a migração de células no interior da matriz. Para superar esta desvantagem, uma possível solução consiste em cortar a matriz em módulos «unidade». Infelizmente, o tamanho e forma das partículas de diversidade pode dificultar a embalagem em estruturas em camadas regulares. Em 7 de Cullen e colaboradores projetou uma construção neuronal 3D feito de neurônios e / ou astrócitos dentro de um extracelular andaime bioativo à base de matriz. Um tecido neural, tais engenharia permitida em investigações in vitro para estudar e manipular as respostas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistiu em neurónios e glia distribuídas por toda a matriz extracelular (ECM) e / ou andaimes de hidrogel (500-600 mm de espessura). Neste condition, uma viabilidade celular óptima (maior do que 90%) foi encontrado por plaqueamento de células, a uma densidade de cerca de 3,750 definitiva – 5000 células / mm3. Deve-se notar que um tal valor de densidade é muito menor do que a da condição in vivo, onde a densidade das células do córtex cerebral do rato é de cerca de 90.000 células / mm 3 14. Para superar esta limitação Pautot e colaboradores 15 realizado um sistema 3D in vitro em que a densidade celular e a conectividade de rede são controladas para se assemelhar a condições in vivo, permitindo simultaneamente imagens em tempo real da rede. Na prática, este método baseia-se no conceito de que os neurónios dissociados em cultura são capazes de crescer em microesferas de sílica. Estas contas fornecem uma superfície de crescimento grande o suficiente para os corpos celulares neuronais para aderir e para as suas arborizações para crescer, amadurecer, se estendem, e definem contatos sinápticos para outros neurônios. Este método explora as propriedades espontâneas de montagem de contas monodispersas para form 3D em camadas matrizes hexagonais contendo subconjuntos distintos de neurônios em diferentes camadas com conectividade restrita entre os neurônios em diferentes esferas. A densidade celular obtida com este método foi de cerca de 75.000 células / mm3.
Recentemente, nós adaptamos o método de Pautot aos MEA 16: os resultados obtidos mostram que a atividade eletrofisiológica 3D apresenta um repertório mais vasto de actividades do que aquela expressa por redes 2D. Culturas maduras 3D exibem uma dinâmica reforçada em que ambos estouro de rede e aleatória coexistem pico de atividade. Da mesma forma, Tang-Schomer e colaboradores 17 realizado um andaime poroso à base de proteína de seda que mantém uma cultura primária cortical in vitro para alguns meses, e registada a actividade electrofisiológica por meio de um eléctrodo de tungsténio.
Neste trabalho, os procedimentos experimentais para construir redes neuronais 3D acoplados aos MEA será descrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, um romance experimental em plataforma vitro composta de 3D engenharia culturas neuronais acoplados a AAM para eletrofisiologia rede foi apresentada. A utilização de micropérolas como andaime para permitir que o crescimento neurítico ao longo da -axis Z foi adaptado para ser integrado com o MEA planar. Desta forma, os resultados obtidos micro-sistema em um modelo in vitro 3D válido e confiável para estudar a dinâmica eletrofisiológicos emergentes 16.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Giorgio Carlini pelo apoio técnico no desenvolvimento da estrutura de confinamento e dott. Ornella LoBrutto para a revisão completa do manuscrito. A investigação conducente a estes resultados beneficiaram de financiamento do 7º Programa-Quadro da União Europeia (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET jovens exploradores esquema), sob acordo de subvenção 284.772 CÉREBRO BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
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