Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Понимание механизмов, с помощью которых мембранные белки выполнению их функции клетки часто может быть сложной задачей, потому что их способы действия часто определяется низким сродством взаимодействия, которые трудно обнаружить и оценить с помощью традиционных биохимических методик. Мембранные белки, кроме того, может быть сильно обогащены специфическими мембранными доменами или 5,6 образующих динамические высокие структуры порядка, которые, в принципе, изменяют свою биологическую активность 7.
Неинвазивная помощью лазера флуоресценция одна молекула микроскопии, таким образом, стать методология выбора для изучения поведения белка в сложных клеточных средах. Это, в частности, справедливо для биохимических процессов, происходящих в плазматической мембране, так как они могут быть в принципе контролироваться в уменьшенным шумом полного внутреннего отражения (TIRF режиме). Вот образец освещение ограничено до до 200 нм тонкий ломтик в непосредственной близости к стеклу суrface, что приводит к значительной потере в сотовой фоне и из-за характеристик затухающих возбуждающего света, а также к существенному увеличению интенсивности флуоресценции 8,9 сигнала. Оба аспекта важны, когда стремится к высокой позиционной и временным разрешением в обнаружении одной молекулы.
Плоские SLBS не только совместимы с TIRF микроскопии. Когда функционализирован соответствующими лигандами они также обеспечивают прямой доступ к изучению молекулярной динамики признания клетка-клетка, как они происходят в иммунных клетках или других клетках. Они также могут быть просто использованы в положение подвижных и иным, не прилипшие клетки достаточно близко к стеклу, так что такие клетки могут быть отображены в TIRF освещения, что весьма желательно при эксперименты проводимости, включающие отслеживание одной молекулы или сверхразрешения одной молекулы на основе. Для этого белки должны быть загружены в очень мобильном SLB. Неотъемлемым преимуществом используемого Li PIDs в том, что нет неспецифического связывания белков вообще. Кроме того, SLBS можно рассматривать как двумерные жидкостей с присущей ему способностью исцелять себя; неровности в пределах стеклянной подложки компенсируются до определенной степени. Шаг за шагом протокол при условии, чтобы произвести очень мобильные бислои заряженные с белками интерес. Образование плоских SLBS описано, которые содержат 1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC) в качестве основного ингредиента (90-99%) и синтетических и функционализированный липидного 1,2-dioleoyl- SN-глицеро-3 – {[Н (5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусной кислоты] сукцинил} никелевую соль (АРД НТА-Ni) в низкой численности (1-10%). POPC несет один насыщенной жирной кислоты и одну моно-ненасыщенной жирной кислотой и образует бислоев высокой текучестью даже при комнатной температуре. DGS НТА-Ni связывается с его головной группы на полигистидиновый хвостами и служит якорем для поли-гистидин-меченных белков выбора (рисунок 1).
"> Важно отметить, что микроскопии оборудование должно включать в себя ряд периферийных устройств, которые описаны ниже. С информацией, предоставленной и некоторые базовые знания в области оптики и лазерной физики, любой биолог должен быть в состоянии создать единую установку изображения молекулы. Образец возбуждение должно быть в идеале осуществляется на инвертированный микроскоп в полное внутреннее отражение режиме (TIRF), как этот режим уменьшает паразитные свет и чрезмерное фона, возникающего в противном случае из ячеистого автофлуоресценции 9. Для этого, специальная TIRF-способных цель (см ниже) и лазерная подсветка не требуется. Некоторые эксперименты требуют раз освещение в пределах миллисекунд и работать в быстрой последовательности. Чтобы сэкономить время освещения, или чтобы избежать ненужных отбеливание вызванного повторяющимся освещения, часто бывает полезно разделить излучаемого света в двух или более спектральных каналов. Это позволяет одновременно считывания из двух или более профилей выбросов, которые могут стать важным фактором, когда ПОВЕДЕНИЯTing эксперименты с Ферстер резонанс переноса энергии (FRET). Здесь выбросов в результате однократного импульса возбуждающего света может быть записан как от донора рвать и FRET акцептором (как сенсибилизированной излучения). Камера должна захватить достаточное количество фотонов, с достаточно низким фоне визуализировать отдельные флуорофоры во время освещения. Компьютерное программное обеспечение должны быть до задачи синхронизации закрывание возбуждения и получения изображения. Исчерпывающий обзор приведен ниже и на рисунке 2:TIRF-способным Цель: Для объективной основе TIRF освещения числовая апертура (NA) объектива должна быть равна или больше, чем 1,4 с использованием стандартных стеклянных слайдов (N = 1,515) 9. Увеличение может составлять от 60x до 150x. Цель должна быть исправлена хроматически для обеспечения confocality при визуализации различных флуорофоры.
Лазеры: Число имеющихся ЛасеВарианты г значительно увеличилось за последние годы. Современные электронном модулируемого непрерывного излучения диодных лазеров являются экономически эффективными и могут эксплуатироваться с беспрецедентной частотой и скоростью. Более дорогие газа ионные лазеры превосходят по качеству лазерного луча, но требуют внешнего закрывание (см ниже) и часто обширный (водных) охлаждения.
Возбуждение жалюзи: акустооптического модулятора (АОМ) позволяют быстро закрывание в быстрой последовательности 10. Для жесткой закрывая комбинацию ОСО с механическими жалюзи рекомендуется. Таким образом обширные нагрев ОСО из-за непрерывного освещенности избежать утечки света и от отита в выключенном положении компенсируется.
Линзы используются, чтобы расширить лазерные лучи и фокусировать их на задней фокальной плоскости объектива. Таким образом, свет возбуждения покидает цели в качестве параллельного пучка (рис 3), который требуется для TIRF освещенияобразец. Перемещение координационным центром в задней фокальной плоскости от центра в периферии цели будет изменить угол, под которым луч покидает цели, но не местоположение лазерного пятна на образце (фиг.3), которая является функцией от общего геометрии луча. TIRF освещение наступает в критический угол, который можно регулировать с помощью набора, функционирующих как перископ, чтобы перевести фокус лазера в фокальной плоскости объектива зеркал. Линзы должны быть исправлены хроматической и может быть использован в наборе двух или трех линз. Система трех линз состоит из двух линз, действующих, как телескоп, чтобы расширить лазерный луч (и, следовательно, освещение пятна на образце) и третий объектив, чтобы сосредоточиться на расширенную луч в задней фокальной плоскости объектива (рисунок 4). Обе функции (телескоп и фокусировки), также может быть достигнуто с помощью комбинации только двух линз (рисунок 4).
<p class="jove_content"> Зеркала должно быть не менее 95% отражательной чтобы избежать потери лазерного света. Для каждой регулировки пучка набор из двух зеркал обычно применяется в качестве такого расположения является достаточно точно настроить любой угол и положение лазерного луча.Дихроичных накладки отражать и пропускать свет разных длин волн, указанных и используются для наложения или разделить пучки из двух лазеров.
Polychroic фильтры более сложны, чем дихроичных фильтров и нужно, чтобы отразить входящий возбуждающий свет и передавать выхода светового излучения от образца. Они размещены в кубе фильтра между объективом и микроскоп трубки объектива.
Очистка фильтров: в зависимости от типа лазера служащий д лазера очистить фильтры с узкой полосы пропускания должны быть помещены на лазерный луч прямо после выхода из лазера.
Notch фильтрыпредназначены для эффективно поглощать лазерное излучение с узкой полосой пропускания и передавать все другие легкие. Они размещены в пути излучения, чтобы отфильтровать любые ложные свет лазерного возбуждения. Тем не менее, режекторные фильтры работают только при 0 ° входящего угла. Если ширина полосы режекторного фильтра очень острые, разные углы входящие не могут быть отражены больше. Блокирование Коллимированный лазерного лазерного излучения не влияет, но обратно-рассеянного света не может быть эффективно препятствовало достижению камеру.
Моторные колеса фильтр оснащен соответствующими фильтрами колес может быть легко помещается в возбуждения и испускания пути и позволяют простой переключение между различной интенсивности света (при ношении ND фильтров) или люминесцентных каналов (при размещении в передней части дуги ксеноновой лампы или ртутной для Логометрический визуализации кальция или перед камерой, чтобы выбрать для излучающей флюорофора).
50:50 куб светоделитель сап используется для разделения лазерные лучи на два отдельных пучка возбуждения путей, а также объединить их в передней части перископа.
Светоделитель (путь выбросов): Для быстрого получения изображения без каких-либо необходимости внесения изменений физических фильтров, луч излучение разделяется на сине-смещается и красное смещение канала. В принципе, светоделители могут быть построены с использованием дихроичное клин или набор зеркал и дихроичное зеркало, чтобы отделить луч излучения в длине волны-зависимым способом. Два фильтра выбросов необходимы для очистки испускаемых каналов.
Пространственный фильтр Пространственная фильтрация пучка возбуждения иногда требуется удалить непараллельных световые лучи, испускаемые лазерными лучами низкого качества. Пространственный фильтр состоит из двух линз телескопа с небольшим отверстием расположен точно в фокусе обоих объективов. Таким образом ложные света в результате непараллельных участках лазерного луча становится эффективно заблокирован. СуCH условия должны быть выполнены при установлении TIRF основе микроскопии. Пространственной фильтрации возрастает с меньшими отверстий, которые более трудно позиционировать в фокальной точке, и с меньшими фокусными расстояниями первой линзы. Чтобы уменьшить эффекты, вызванные аберраций линзы целесообразно использовать вместо простых линз высокого качества и бесконечности коррекцией микрообъективов с небольшим увеличением (10x или 20x).
Перископ: а настройка перископ необходимо перевести сфокусированного лазерного пучка в задней фокальной плоскости объектива, необходимое условие для визуализации TIRF. Это может быть легко построена из двух двух-дюймовый зеркал, поступательного стадии для регулировки первое зеркало и пост для размещения второго зеркала, чтобы отразить расширенную и сфокусированный луч возбуждения в микроскоп (рисунок 5).
Которые обычно используются с задней подсветкой электронного умножения Зарядка соединенные устройства (EMCCD) для: камеразапись одиночных сигналов молекулы. Это из-за их высокой квантовой эффективностью (до 95%), с высокой скоростью сбора (до 30 МГц) и сравнительно низкий уровень шума. Охлаждение до -80 ° С уменьшает тепловой шум и поддерживается ряда имеющихся в настоящее время EMCCD камер. Ограничением технологии EMCCD, что шум камеры линейно возрастает с обоих усиления камеры и сигнал захвата. Это не тот случай с научными КМОП (sCMOS) камер, которые значительно дешевле и работают благодаря специальной архитектуре чипа sCMOS также гораздо быстрее, чем камер EMCCD. Однако проблема, связанная с КМОП-технологии является то, что получение изображений до сих пор нет какой-то степени количественного считывания на одном уровне молекулы, потому что каждый пиксель имеет разную чувствительность обнаружения. В принципе это может быть компенсировано за счет нормализации пиксельного, но эта процедура не тривиально 11. Вот почему мы все еще колеблетесь повторнооцениваем sCMOS камеры для микроскопии одной молекулы, но в связи с быстрым развитием этой технологии, камеры sCMOS может вскоре стать камера выбора. Медленные сканирования CCD камеры камеры избежать усиления шума, связанные с и пиксель дисперсию все вместе и поддерживать высокие темпы приобретения, если они могут работать в так называемом режиме «кинетического». В этом режиме вся чип камеры для области процентных (ROI), за исключением маскируется, что позволяет использовать сам чип в качестве устройства хранения данных. После того, как ROI подвергается впервые, в результате заряды смещаются в маскированной области чипа пикселей строке пикселей линии, где изображение защищено от дальнейшего воздействия света. После того, как смещение всех линий ROI в маске области завершена (в диапазоне суб-миллисекундного), сам ROI готова к следующей экспозиции. Этот цикл повторяется, пока все пиксельные строки ПЗС-матрицы не заряжается. Чип затем зачитал медленно заметно РедуCED шум считывания. Например, на пиксель чипа 1000 х 1300, 20 трансформирования из 50х50 пиксела могут быть записаны в быстрой последовательности. Поскольку изображения остаются на чипе в течение значительного времени, прежде чем зачитать, это имеет решающее значение для обеспечения высокого качества маскировки и охладить камеру (например, с помощью жидкого азота) в качестве средства для снижения избыточной тепловой шум. Некоторые EMCCD камеры также поддерживают режим кинетическую.
Программное обеспечение: Сроки лазеров, жалюзи, АОМ и экспозиции камеры, а также надлежащее хранение изображений, являются неотъемлемой любого успешного эксперимента изображений. В принципе многие определенные операции могут быть запрограммированы с имеющимися программными пакетами, которые приходят с камерой. Коммерческие пакеты программного обеспечения поддерживает большое количество периферийных устройств, которые могут быть реализованы с небольшим техническим ноу-хау.
Генератор импульсов, сбора данных (DAQ) плата (с аналоговыми и цифровыми выходными каналами) и осциллограф: Импульсный генератор являетсяотличный выбор для преобразования импульсов запуска в импульсы определенного времени и напряжения. Это способ лазеры можно точно контролировать для выходной мощности и приурочен миллисекунды в диапазоне суб-миллисекунд. DAQ платы с аналоговыми выходами достичь того же и легко интегрируются в материнскую плату компьютера с помощью слотов PCI. Длительность импульса, амплитуда и частота проверяются с помощью осциллографа.
Вложение всего пути луча возбуждения: Чтобы избежать колебания в профиле возбуждения из-за воздушных конвекции весь путь луча возбуждения должен быть закрытых от его лабораторной среде. Эта мера особенно важна при проведении TIRF микроскопии. Оптические компоненты также защищены от пыли и человеческого глаза от лазерного воздействия света. Корпуса могут быть легко строить из черной доске карты, которые можно купить в магазинах искусств.
Для определения текучести Recovery SLB флуоресценции После PhotobleacХин (FRAP) измерения 12 выполняются. Для FRAP существование двух путей пучка возбуждения целесообразно (рисунок 3). Первый путь луча предназначен для изображения флуоресценцию бислой. Это может быть сделано в конфигурации TIRF и с низким интенсивности света. Второй путь луча должна обеспечивать короткий, но интенсивный импульс отбеливатель и должны быть настроены в не-TIRF режиме, так что она покидает цели вдоль оптической оси. Круглый диафрагмы могут быть помещены в пути луча возбуждения (рисунок 8), чтобы проецировать совершенно круглый профиль отбеливателя с четкими краями. Для того, чтобы изображение это отверстие на плоскости объекта, его оптимальное положение будет в фокальной плоскости объектива 3 (смотри рисунок 3). Тем не менее, из-за большого фокусного расстояния этой линзы, отверстие изображение достаточно высокого качества может также быть получены, когда апертура находится в слегка сдвинуты позиций.
После выполнения тон визуализации эксперимент исходные данные должны быть проанализированы надлежащим образом. Несколько шаг за шагом протоколы предложил, которые охватывают регулировку основных настроек (например, силовых освещение и время, угол TIRF), сбора и анализа данных.
Одноместный микроскопии молекулы обеспечивает уникальную возможность для изучения поведения белков в родном клеточной среде. Молекулярная визуализация, поэтому все более привлекательными для широкого научного сообщества, однако многие ученые до сих пор жизнь уклоняться от первоначальных инвестиций в технологии и опыт. Основное преимущество, возникающие от сборки собственной системы визуализации является то, что можно легко регулировать, чтобы конкретные потребности никто.
Как предложено здесь не-TIRF луч возбуждения может быть легко реализованы в дополнение к существующей пути TIRF света, если быстрый и определяется фото-отбеливание (или: активация) флуорофоров и лигандов, например, желаемые при выполнении FRAP или лиганд uncaging эксперименты 14 , Введение из пучка излучения разветвитель позволяет одновременной записи по меньшей мере двух, а в некоторых случаях до четырех люминесцентных каналов. Список расширений в сущности, ограниченной толькосвое собственное воображение.
Например, реализация моторизованный фильтра выбросов колесо в пути излучения позволяет для быстрого переключения между до десяти различных флуоресцентных каналов. При объединении двух моторизованных фильтром твердых колес (каждый из которых оснащен слотами 10 фильтра), соединенных последовательно, до 18 флуоресцентных каналов могут быть считаны. Изображений TIRF основе могут быть дополнены с измерениями мобилизации кальция и помех Отражение микроскопии (IRM) после интеграции пути лампы возбуждения ксеноновой или ртутной. IRM является методом выбора для визуализации степень, в которой клетки прикрепляются к поверхности стекла или SLB и, следовательно, может обеспечить критическую информацию при интерпретации данных визуализации TIRF основе. Установление луч расширенную возбуждения с использованием простого дихроичного зеркала и дополнительного лазера 405 нм позволяет проводить локализации фотоактивация микроскопии (Palm) или стохастической микроскопии оптической реконструкции (грозовых), то есть два superresolutионные методологий с позиционной точностью ниже дифракционного предела видимого света 15,16.
Тем не менее, экспериментальное успех не только вопрос соответствующего оборудования. Для того, чтобы в полной мере воспользоваться TIRF основе изображений с уменьшенным шумом, клетки должны сделать контакт с поверхностью в моде, что не накладывает ограничений на клеточной поверхности или, что мешает физиологии их плазматической мембране. SLBS функционализирован соответствующие белки для клеточной адгезии превышают хорошо подходит для этой цели, потому что все SLB-встроенные лиганды с боков мобильного и настроить их боковую позицию в бислой в ответ на связывание с рецептором и сегрегации динамику.
Для изготовления SLBS воспроизводимым образом, лучше всего начать с внедорожников высокой чистоты. Как описано здесь, это, таким образом, важно, чтобы удалить пузырьки, многослойные которые также произведенные во ультразвуком, в два этапа, поскольку эти ультрацентрифугирования Interfere с образованием смежных SLBS, показывающих высокую текучесть. SLBS из формы высокого качества только на чистых стеклянных поверхностей. После очистки предметные стекла следует использовать немедленно или хранить в вакууме. Важно отметить, что SLBS никогда не должны подвергаться воздействию воздуха, так как это приведет к их разрушению. SLB стиральная включает, как показано, буфер промывки с использованием серологического пипетки, так как это не только сохранить, но процедура также экономия времени.
В процессе уборки и очистки SLB-резидентов белков применение моющих средств следует избегать. Это потому, что моющее средство снизит мобильность белка значительно, даже когда они присутствуют в следовых количествах. Чтобы обойти потребность в моющем средстве вместе, растворимый секретируемый выражение полигистидиновой метки оборудованный лигандов рекомендуется в клетках млекопитающих или насекомых. Если рефолдинга из телец включения E.coli требуется осторожность должна применяться для удаления моющих средств эффективно из телец включения до их непредставленных и повторной укладки,
Основным преимуществом использования SLBS результаты от своей модульной и преобразовываю- природы, которая позволяет специально препарировать роль данного рецептора-лиганд взаимодействия для активации клеток и клеточной адгезии. В связи с этим важно, чтобы отметить, что АРД НТА-Ni должен присутствовать в 10% в пределах SLB, чтобы предотвратить белков, конкурирующих за НТА-Ni сайтов связывания. При использовании SLBS укрывательство только 1% или 2% DGS НТА-Ni, снижение объединения данной полигистидиновые-тегами видов белка можно заметить, особенно при совместном инкубации увеличивается количество секунды полигистидиновые метками видов белка (не опубликовано наблюдение). Это явление не наблюдается при работе с SLBS, показывающих 10% DGS NTA-Ni.
В то время как мы никогда не наблюдали неспецифическое связывание любого полигистидиновая-меченого белка в тестируемой SLBS содержащих АРД NTA-Ni, эта возможность должна быть проверена при введении белка в первый раз,Для этого мы рекомендуем использовать SLBS лишенных DGS-NTA Ni (белок не должен связывать). Во-вторых, при использовании SLB, содержащий DGS NTA-Ni, белок должен оторваться полностью после мытья SLB с PBS, содержащего 300 мМ имидазола.
Еще одним важным преимуществом использования SLBS, что переходные взаимодействия и сигнализации события могут быть проверены с повышенной пространственно-временной резолюции 17-19. Это, по крайней мере отчасти потому, что трехмерный процесс скрепления по существу сводится к двум измерениям изображений, особенно при записи в шума ослабленный режим TIRF. Использование SLBS совместим с обнаружением сигнала одна молекула, предпосылки для фото-активированный локализации микроскопии (PALM) или стохастической оптической микроскопии реконструкции (STORM), т.е. сверхразрешения микроскопии с разрешением ниже дифракционного предела 15,16. Эти специальные условия возможности позволяют одной молекулы Форстер резонансной энергии Transfer эксперименты предназначены для визуализации отдельных белок-белковых взаимодействий в синаптическую среды 20. Этот подход объясняется довольно подробно в Jove публикации называется "Измерение ТКР ПКИКЖ связывания с использованием FRET основе микроскопии анализа" 21.
При интерпретации экспериментов SLB-основанные всегда должны иметь в виду, что не все свойства плазматической мембраны живой клетки являются признакам по SLBS, и что некоторые из пропавших без вести качеств может повлиять на физиологию под следствием. Ведь, SLB-встроенные белки свободно диффундирующих и не организованы в мембранных микродоменов, как большинство их коллег сотовых являются 5,6,22. Прикол в плазме листы мембраны, полученные из адгезивных клеток, которые сохраняют плазмы мембраны архитектуру живых клеток в какой-то степени, были успешно использованы для изучения поглощения с мембраной встроены антигенов В-лимфоцитов 23. Тем не менее, даже такоймембраны не взаимодействуют с динамичной цитоскелета и не имеют никакой гибкости, поскольку они поддерживаются жесткой поверхности стекла. Ввиду этих расхождений, очевидно, существует потребность в инженерных SLBS, которые предлагают средства для полочкам белки в определенном моды и которые поддерживаются поверхностей регулируемым гибкости или поверхностей, которые меняют свою жесткость в ответ на локально применяемых световых импульсов.
The authors have nothing to disclose.
М. была поддержана Шредингера общении Австрийским научным фондом (FWF, J3086-B11) и благодарит Макса Планка общества на финансовую и административную поддержку. С. была поддержана Венской науки и техники (КОС фонда, LS13-030). JH при поддержке Венской науки и техники (КОС фонда, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |