Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Bunların etki modları genellikle konvansiyonel biyokimyasal metodolojiler ile algılamak ve değerlendirmek zor olan düşük afinite etkileşimleri, tarafından tanımlanan çünkü zarı proteinleri kendi hücresel işlevlerini yerine hangi mekanizmaların anlaşılması genellikle zor bir görev olabilir. Zar proteinleri, ayrıca yüksek prensip bunların biyolojik aktivitesini 7 değiştirebilir spesifik membran etki 5,6 veya dinamik yüksek düzeyde yapılar oluşturma bölgesi zenginleştirilebilir.
Non-invaziv lazer yardımlı tek molekül floresan mikroskopi ve böylece kompleks hücresel ortamlarda protein davranışlarını incelemek için seçim metodolojisi haline gelmiştir. Bu prensip olarak gürültü azaltılmış Toplam İç Yansıma (TIRF) modunda izlenebilir gibi bu, özellikle plazma membranında meydana gelen biyokimyasal süreçler için de geçerlidir. İşte örnek aydınlatma cam su yakın 200 nm-ince dilim bir yukarı sınırlıdırflüoresan sinyal yoğunluğunun 8,9 önemli bir artış nedeniyle kaybolan uyarma ışık özelliklerine hücresel arka önemli bir kayıp ile sonuçlanır ve rface. Tek molekül tespiti yüksek pozisyonel ve temporal çözünürlük hedefleyen her iki yönü önemlidir.
Düzlemsel SLBs TIRF mikroskopi ile sadece uyumlu değildir. Uygun ligandlar ile işlevlendirilmektedir onlar ayrıca, bağışıklık hücrelerinin veya başka hücrelerden meydana gibi hücre-hücre tanıma moleküler dinamik okuyan doğrudan erişim sağlar. Ayrıca, sadece bu tür hücreler, son derece arzu edilir TIRF aydınlatma, görüntülü böylece cam slayt yakın hareketli ve aksi takdirde yıkanarak yapışmayan hücreler konumlandırmak için kullanılabilmektedir zaman tek bir molekül izleme veya tek molekül bazlı SuperResolution içeren iletim deneyleri. Bu amaçla proteinler, kolayca taşınabilir SLB üzerine yüklenmiş olması gerekir. Kullanılan li bir doğal avantajı PID'ler tüm proteinlerin herhangi bir spesifik olmayan bağlanma olduğu bulunmaktadır. Ayrıca, SLBs kendilerini iyileştirmeye içsel bir kapasiteye sahip iki boyutlu sıvı olarak kabul edilebilir; cam destek içindeki düzensizliklerin belli bir dereceye kadar telafi edilir. Bir adım aşamalı protokol ilgi konusu olan proteinlerin görevli yüksek hareketliliğe sahip iki katmanlı yapılar oluşturmak için temin edilmiştir. Düzlemsel SLBs oluşumu ana madde (90-99%) ve sentetik olarak 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) ihtiva eden, tarif edilen ve lipid, 1,2-dioleoil-işlevlendirilmektedir sn -glisero-3 – {[N- (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit] süksinil} nikel tuzu az bulunan (% 1-10) 'de (EGM NTA-Ni). POPC bir doymuş yağ asidi ve bir mono-doymamış yağ asidi taşıyan ve hatta oda sıcaklığında yüksek akışkanlık lipit katmanlarını oluşturur. DGS NTA-Ni poli-histidin kuyruğuna onun baş grubu ile bağlanır ve seçim poli-histidin-etiketli proteinler (Şekil 1) için çapa görevi görür.
"> Önemlisi, mikroskopi donanım sağlanan bilgilerin ve optik ve lazer fiziği bazı temel bilgi ile, herhangi bir biyolog, tek bir molekül görüntüleme kurulumu inşa etmek mümkün olmalıdır. Aşağıda açıklanan çevre birimlerinin bir dizi içermelidir. Örnek uyarma ideal olmalıdır Toplam İç Yansıma (TIRF) modunda ters bir mikroskop üzerinde gerçekleştirilen bu rejim Bunun için özel bir TIRF yetenekli hedef (aşağıya bakınız). sahte ışık ve hücresel oto-floresan 9'dan aksi ortaya çıkan aşırı arka plan azaltır ve lazer aydınlatma gerektiği gibidir. Bazı deneyler milisaniye aralığında aydınlatma sürelerini gerektiren ve peş peşe ameliyat olacak. aydınlatma Zaman kazanmak için ya da iki veya daha fazla spektral kanal içine yayılan ışığı bölmek için genellikle yararlıdır tekrarlayan aydınlatma kaynaklanan gereksiz ağartma önlemek için. Bu eşzamanlı okuma sağlar zaman iletkenlik önemli bir faktör olabilir, iki veya daha fazla emisyon profilleri,Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) içeren ting deneyleri. Burada tek uyarılma ışık palsının ortaya çıkan emisyon hem FRET vericiden kaydedilir ve (sensitize emisyon olarak) kabul FRET edilebilir. Kamera aydınlatma süresi boyunca tek fluorophores görselleştirmek için yeterince düşük bir arka plan ile yeterli fotonları yakalamak gerekir. Bilgisayar yazılımı uyarma kapatılmasını ve görüntü alımı senkronize etmek görevin kadar gerekecektir. Kapsamlı bir bakış aşağıda Şekil 2'de verilmektedir:TIRF yetenekli hedefi: nesnel tabanlı TIRF aydınlatma için objektif sayısal açıklık (NA) eşit ya da standart cam slaytlar kullanarak 1.4 daha büyük olmalıdır (n = 1,515) 9. Büyütme 150X için 60x arasında değişebilir. Amacı, kromatik farklı florofor görüntülerken, belirli confocality izin vermek için düzeltilmelidir.
Lazerler: Mevcut Lase sayısır seçenekleri önemli ölçüde son yıllarda artmıştır. Modern elektronik modüle sürekli dalga diyot lazerler düşük maliyetli ve görülmemiş frekans ve hız ile çalıştırılabilir. Daha pahalı gaz iyon lazerleri Lazer ışın kalitesi excel, ancak soğutma dış kapatılmasını (aşağıya bakınız) ve genellikle geniş (Su) gerektirir.
Uyarma panjurlar: Acousto-optik modülatörler (AOM) peş peşe 10 hızlı kapatılmasını sağlar. Sıkı mekanik kepenkleri ile AOM kombinasyonunu kapatmak için tavsiye edilir. Nedeniyle sürekli ışık maruz kalma AOM Bu şekilde geniş ısıtma önlenir ve off-pozisyonunda AOM sızan ışığı iptal edilir.
Lensler lazer ışınları genişletmek ve objektif arka odak düzlemi üzerine onları odaklamak için kullanılır. Bu şekilde, uyarma ışık TIRF aydınlatma için gerekli olan bir paralel ışın (Şekil 3) gibi objektif bırakırörnek. Objektif çevresine merkezine arka odak düzlemi içinde odak noktası hareketli ışın hedefi bırakır hangi açısını değiştirmek, ancak bir işlev numune lazer nokta yeri (Şekil 3), değil ki olacak Genel ışın geometrisi. TIRF aydınlatma hedefi odak düzlemi içinde lazer odak noktasını çevirmek için bir periskop olarak işleyen aynalar bir dizi kullanarak ayarlanabilir kritik açıyla gelişir. Lensler kromatik olarak düzeltilmesi gerekmektedir ve iki ya da üç, bir dizi lens kullanılabilir. Üç mercek sistemi objektif (Şekil 4) arka odak düzlemi içine genişlemiş ışını odaklamak için lazer ışını (ve dolayısıyla numune de aydınlatma spot) ve üçüncü bir lensi genişletmek için bir teleskop gibi davranan iki lens oluşur. Her iki fonksiyon (teleskop ve odaklanma) Ayrıca sadece iki lens kombinasyonu ile elde edilebilir (Şekil 4).
<p class="jove_content"> Aynalar lazer ışığının kaybını önlemek için en az% 95 yansıtıcı olmalıdır. Iki ayna bir dizi genellikle düzenleme olarak uygulanır ve her bir ışın ayarı için hassas bir lazer ışınının bir açı ve konumunu ayarlamak için yeterlidir.Dikroik kaplamaları yansıtır ve farklı belirtilen dalga boylarında ışık iletim ve üst üste ya da iki lazer ışınları bölmek için kullanılır.
Polychroic filtreler dikroik filtreleri daha karmaşıktır ve gelen uyarma ışık yansıtır ve numuneden emisyon ışığı çıkan iletmek için gereklidir. Bunlar objektif ve mikroskop tüp lens arasındaki filtre küp içerisine yerleştirilir.
Filtreleri temizleyin: Lazer employe d lazer türüne bağlı olarak bu lazer bırakır hemen sonra lazer ışınına konulmalıdır dar iletim bant genişliği filtreleri temizlemek.
Yivli filtreleretkin bir şekilde dar bantlı, lazer ışığı emer ve diğer ışık göndermek için tasarlanmıştır. Onlar herhangi bir sahte lazer ikaz ışığı süzmek için emisyon yolu içinde yerleştirilir. Ancak, çentik filtresi 0 ° gelen açıda sadece çalışır. Çentik filtresi bant genişliği çok keskin ise, farklı gelen açıları artık yansıtılmamış olabilir. Paralelleştirilmiş lazer lazer ışığının Engelleme etkilenmez, ama geri saçılan ışık verimli kamera ulaşmasını engellemiştir olmayabilir.
Rasyometrik bir ksenon veya cıva arklı bir lambayla önüne yerleştirilen, uygun filtreler tekerlekler ile donatılmış motorlu filtre tekerlekler kolay eksitasyon ve emisyon yolu içine yerleştirilir ve farklı ışık yoğunluklarında (ND filtrelerle donatılmıştır zaman) ya da flüoresan kanallar (arasında basit geçmesine izin edilebilir kalsiyum görüntüleme veya kamera önünde) yayan fluorofor için seçin.
50:50 küp ışın ayırıcı cBir, iki ayrı uyarma ışın yolları içine lazer ışınları bölmek için kullanılan ve aynı zamanda periskop önünde bunları birleştirmek.
Işın ayırıcı (emisyon yolu): fiziksel filtre değişiklikleri için herhangi bir ihtiyaç olmadan hızlı görüntü alımı için, emisyon ışını kaymıştır-mavi ve kırmızı-kaymıştır kanala ayrılmıştır. Prensip olarak, kiriş bölücülerin dikroik kama veya aynalar seti ve dalga uzunluğuna bağlı bir şekilde emisyon ışını ayrılması için bir dikroik ayna kullanılarak inşa edilebilir. İki emisyon filtreleri yayılan kanalları temizlemek için gereklidir.
Mekansal filtre: uyarma demetinin Mekansal filtreleme bazen düşük kaliteli lazer ışınları yayılan paralel olmayan ışık ışınlarını kaldırmak için gereklidir. Bir uzamsal filtre hem lenslerin odak noktasında tam yerleştirilen küçük bir iğne deliği ile iki lens teleskop oluşur. Lazer ışınının paralel olmayan bölümlerden elde edilen Bu şekilde, sahte ışığı randımanlı bir şekilde bloke olur. SuTIRF tabanlı mikroskobu kurarken ch koşulların karşılanması gerekir. Odak noktası haline ve ilk lens küçük odak uzunlukları ile konumlandırmak için daha zordur küçük iğne delikleri ile Mekansal filtreleme artar. Sapmayı kaynaklanan etkilerini azaltmak için bunun yerine basit lensler düşük büyütme (10x veya 20x) ile yüksek kaliteli ve sonsuzluk düzeltmeli mikroskop hedefleri istihdam avantajlıdır.
Periskop: Bir periskop kurulum hedefi, TIRF görüntüleme için bir ön koşul arka odak düzlemi içinde odaklanmış bir lazer ışını çevirmek gereklidir. Kolayca iki iki inç aynalar, ilk ayna ve genişledi ve mikroskop içine uyarma kiriş odaklı (Şekil 5) yansıtmak için ikinci ayna konumlandırmak için bir yazı ayarlamak için bir öteleme aşamada inşa edilebilir.
Kamera: Arka-aydınlatmalı Elektron-Çarpma Charge Coupled Devices (EMCCD) rutin kullanılırtek bir molekül sinyallerinin kaydı. Bunun nedeni yüksek kuantum verimliliği yüksek satın alma hızı, (% 95 kadar) (30 kadar MHz) ve nispeten düşük gürültü. -80 ° C kadar soğutma, termal gürültüyü azaltır ve mevcut EMCCD kameralar tarafından desteklenir. EMCCD teknolojisinin bir sınırlama kamera gürültü kamera kazancı hem de doğrusal artar ve sinyal esir olmasıdır. Bunun nedeni sCMOS çipin özel mimari de çok daha hızlı EMCCD kameralara göre önemli ölçüde daha az pahalı ve işletmek, bilimsel CMOS (sCMOS) kameralar, durum böyle değildir. Her piksel, farklı algılama hassasiyetini özellikleri nedeniyle Ancak CMOS teknolojisi ile ilgili bir sorun, o görüntü elde etme hala tek bir molekül düzeyinde bir nicel okuma bir dereceye yoksun olduğunu. Prensip olarak bu piksel normalleşme yoluyla telafi edilebilir, ancak bu prosedür 11 önemsiz hiçbir şekilde. Bu hala yeniden tereddüt nedentek molekül mikroskopi için sCMOS kameraları takdir, ancak bu teknolojinin hızla gelişmesi açısından, sCMOS kameraları yakında seçim kamera haline gelebilir. Yavaş tarama CCD kameralar kameralar hep birlikte büyütme ile ilgili gürültü ve piksel varyans önlemek ve onlar sözde 'kinetik' modunda çalıştırılabilir eğer hızlı alım hızları destekler. Bu modda faiz (ROI) bir bölge hariç tüm kamera çipi olarak mümkün bir depolama aygıtı olarak çip kendisi istihdam kılan maskelenir. YG ilk kez maruz sonra, ortaya çıkan masraflar görüntü daha ışığa maruz korunmaktadır piksel satır yonga piksel hattı, maskeli alana kaydırılır. Maskelenmiş bölgeye ROI tüm hatlar vites değiştirme (milisaniyenin aralığında) tamamlandıktan sonra, YG kendisini Bir sonraki pozlama için hazırdır. CCD çipi tüm piksel çizgileri tahsil edilinceye kadar bu döngü tekrarlanır. Çip sonra belirgin Kır ile yavaşça okunurCED okuma gürültü. Bir x 1300 piksel 1000 çip üzerinde, örneğin 50×50 piksel 20 ROI hızlı arkaya kaydedilebilir. Ve görüntüler okumak önce bir süre boyunca çip kalır, çünkü aşırı ısı gürültüsünü azaltmak için bir vasıta olarak (örneğin, sıvı azot ile birlikte), yüksek kaliteli maskeleme sağlamak ve kamera soğumaya önemlidir. Bazı EMCCD kameraları da kinetik modunu destekler.
Yazılım: lazerler, kepenk, AOMS ve kamera maruz zamanlaması yanı sıra uygun görüntü saklama başarılı bir görüntüleme deney ayrılmaz. Prensip olarak birçok tanımlanan işlemleri kamera ile gelen mevcut yazılım paketleri ile programlanabilir. Ticari yazılım paketleri biraz teknik knowhow ile uygulanabilir donanım aygıtları, çok sayıda destekler.
Darbe üreteci, Veri Toplama (DAQ) (analog ve dijital çıkış kanalları) yönetim kurulu ve osiloskop: Bir nabız jeneratörü olanmükemmel bir seçim belirlenen zaman ve gerilim darbeleri içine tetik darbeleri dönüştürmek. Bu şekilde lazerler tam çıkış gücü kontrollü ve alt milisaniyelik aralığında milisaniye içinde zaman aşımına edilebilir. Analog çıkışlar ile DAQ kurulları aynı ulaşmak ve kolayca PCI yuvaları aracılığıyla bilgisayarın anakart entegre edilmiştir. Darbe süresi, genlik ve frekans bir osiloskopla doğrulanır.
Tüm uyarma ışın yolunun Muhafaza: nedeniyle tüm uyarma ışın yolu kendi laboratuar ortamından eklenmelidir ürünün hava uyarım profilinde dalgalanmaları önlemek için. TIRF mikroskopi yaparken Bu önlem özellikle önemlidir. Optik bileşenler de toz ve lazer ışık maruz insan gözünün korunur. Kutular kolayca sanat tedarik mağazalarında satın alınabilir siyah karton, gelen inşa olabilir.
Photobleac sonra SLB Floresan Kurtarma akışkanlığını belirlemek içinHing (sıkı bağlamak) ölçümleri 12 yapılmaktadır. FRAP için iki uyarım ışın yolları varlığı (bakınız Şekil 3) tavsiye edilir. Birinci ışın yolu görüntü iki katmanlı floresan tasarlanmıştır. Bu TIRF konfigürasyonda ve düşük ışık yoğunluğu ile yapılabilir. Optik eksen boyunca hedefe bırakır, böylece ikinci ışın yolu, kısa ama yoğun çamaşır suyu darbe için izin vermeli ve non-TIRF modunda yapılandırılmalıdır. Yuvarlak diyafram uyarma ışın yoluna konabilir tanımlanmış kenarları ile mükemmel yuvarlak ağartma profili proje (Şekil 8). Görüntü için nesnenin düzlemi üzerine bu delik, optimum konumu (bakınız Şekil 3) mercek 3 odak düzlemi içinde olacaktır. Diyafram hafif kaymış pozisyonlarda yerleştirildiği zaman Ancak, bu lensin uzun odak uzunluğu, yeterli kalitede bir açıklık görüntü, ayrıca üretilebilir.
Gerçekleştirilen t yaptıktan sonraO ham veriler uygun analiz edilmelidir deney görüntülenmesi. Birkaç adım adım protokoller edinme ve verileri analiz, ana ayarlara (örn aydınlatma gücü ve zaman, TIRF açısı) ayarı kapsayan, hangi sunulmaktadır.
Tek molekül mikroskopi kendi ana hücresel ortamda proteinlerin davranışlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Moleküler görüntüleme geniş bir bilimsel topluluk, bu nedenle giderek daha çekici hale, henüz birçok hayat bilim adamları hala uzak teknoloji ve uzmanlık ilk yatırım çekiniyorlar. Kişinin kendi görüntüleme sistemi montaj kaynaklanan ana parası hali hazırda kimsenin belli bir ihtiyaca göre ayarlanabilir olmasıdır.
Bu tarifnamede belirtildiği gibi olmayan bir TIRF uyarma ışın kolayca varolan TIRF ışık yolu ek olarak uygulanabilir, floroforlar ve ligandların, hızlı ve tanımlanan foto-ağartıcı (veya -activation) arzu edildiği takdirde, örneğin gerçekleştirilmesi sıkı bağlamak veya ligand uncaging deneyler 14 . Emisyon ışın ayırıcı giriş en az iki eş zamanlı kayıt ve dört flüoresan kanalı bazı durumlarda sağlar. Uzantılarının listesi sadece sınırlı özündeKişinin kendi hayal.
Örneğin, emisyon yolunda bir motorlu emisyon filtresi tekerlek uygulanması kadar on farklı floresan kanallar arasında hızlı geçiş için izin verir. İki motorlu emisyon filtre tekerlekleri birleştiren zaman 18 floresan kanalı okunabilir, seri olarak (her 10 filtre yuvaları ile donatılmış). TIRF tabanlı görüntüleme kalsiyum mobilizasyonu ölçümleri ve Xenon veya Mercury uyarma lamba yolunun entegrasyonundan sonra Girişim Yansıma Mikroskobu (IRM) ile tamamlanabilir. IRM hücreleri cam yüzeyinde veya SLB bağlıdır ve TIRF tabanlı görüntüleme verileri yorumlanırken dolayısıyla kritik bilgi verebilir hangi dereceye görselleştirmek için tercih edilen bir yöntemdir. Basit bir dikroik ayna kullanımı ve fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) ya da stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) iletken veriyor nm 405 ek lazer, yani iki superresolut ile genişletilmiş uyarım ışını KurulmasıGörünür ışık 15,16 kırılma sınırının altında bir konumsal doğruluk ile iyon metodolojileri.
Ancak, deneysel başarı sadece uygun donanım meselesi. Gürültü azaltılmış TIRF tabanlı görüntüleme tam olarak yararlanabilmek için, hücreler, hücre yüzeyinde kısıtlamalar empoze veya plazma zarı fizyolojisi müdahale etmeyen bir moda bir yüzeye temas etmelidir. SLBs Tüm SLB gömülü ligandlar yanal olarak mobil olması ve bağlayıcı ve ayırma dinamikleri reseptör yanıt olarak çift-katlı olan yanal konumunu ayarlamak için hücre yapışması için uygun proteinler, bu amaç için uygundur aştığını ile işlevlendirilmektedir.
Tekrarlanabilir bir şekilde SLBs üretmek için, yüksek saflıkta SUV'lar ile başlamak en iyisidir. Burada tarif edildiği gibi, bu, i, iki Ultrasantrifügasyon adımda da sonikasyon sırasında üretilen çok katmanlı veziküller kaldırmak, böylece kritikYüksek akışkanlık özelliğine sahip, bitişik SLBs oluşumu ile nterfere. Sadece temiz cam yüzeyler üzerinde yüksek kaliteli formunun SLBs. Bir kez temizlenmiş cam slaytlar hemen kullanılabilir veya vakumla saklanmalıdır. Önemlisi, SLBs onların bozulmasına yol açacak bu kadar havaya maruz asla kullanılmamalıdır. SLB Yıkama bu için değil, zaman tasarrufu prosedürü sadece olarak, tampon serolojik bir pipet kullanımı ile durulama, gösterildiği gibi, içerir.
SLB yerleşik proteinlerin toplanması ve saflaştırılması sırasında, deterjan kullanımından kaçınılmalıdır. Bu deterjan bile mevcut eser miktarlarda önemli ölçüde protein hareketlilik azaltacaktır çünkü. Hep birlikte deterjan ihtiyacını aşmak için, salgılanabilir polihistidin etiketi donatılmış ligandların çözünür ifadesi, memeli veya böcek hücrelerine tavsiye edilir. E. coli katma gövdelerinden yeniden katlama gerekli ise, dikkatli bunların olmayan ve tekrar katlama önce, enklüzyon gövdelerinden elde etkili bir madde deterjanların aynlması için uygulanması gereken.
Özellikle hücre aktivasyonu ve hücre yapışması için, belirli bir reseptör-ligand etkileşiminin rol incelemek için sağlar, modüler ve reconstitutive doğadan SLBs sonuçları kullanılarak önemli bir avantaj sağlar. Bu bağlamda, DGS NTA-Ni NTA-NI bağlanma bölgeleri için rekabet proteinleri önlemek amacıyla SLB içinde% 10 mevcut olmalıdır belirtmeyi önemlidir. % 1 veya% 2 DGS NTA-Ni, belirli bir polihistidin-etiketli protein türlerinin birlikte bir azalma barındıran SLBs kullanıldığı zaman yayınlanmamış (özellikle ikinci bir polihistidin etiketli protein türlerinin artan miktarları birlikte inkübe edilmesi zaman fark edilebilir gözlem). % 10 DGS NTA-Ni içeren SLBs çalışırken bu olgu gözlenmemiştir.
Biz DGS NTA-Ni ihtiva eden SLBs test herhangi bir polihistidin-etiketli proteinin spesifik olmayan bağlanma gözlenmiştir hiç birlikte ilk kez bir protein uygulandığında, bu olasılık test edilmelidirBu amaçla biz DGS NTA-Ni (protein bağlamak gerekir) yoksun SLBs kullanmanızı tavsiye ederiz. DGS NTA-Ni içeren bir SLB kullanırken İkincisi, protein PBS 300 mM imidazol içeren SLB yıkadıktan sonra tamamen kapalı gelmelidir.
SLBs kullanıldığı bir diğer önemli avantajı, geçici etkileşimleri ve sinyal olayları geliştirilmiş uzaysal çözünürlük 17-19 ile izlenebilir olmasıdır. Üç boyutlu bir bağlama işlemi, esasen özellikle gürültü zayıflatılmış TIRF modunda kayıt olduğunda, iki görüntüleme boyutlarına azalır, çünkü bu, en azından kısmen bir. SLBs kullanımı tek bir molekül sinyal tespiti, fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) ya da stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) için bir önkoşul, kırınım sınırının 15,16 altında bir çözünürlüğe sahip yani superresolution mikroskobu ile uyumludur. Bu özel görüntüleme yöntemleri tek bir molekül Förster Rezonans Enerji Tra etkinleştirinnsfer deneyler sinaptik ortamda 20 bireysel protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için tasarlanmıştır. Bu yaklaşım, "Measuring TCR-pMHC FRET tabanlı mikroskopi analizi kullanılarak bağlanma" 21 olarak adlandırılan bir jove yayında oldukça ayrıntılı bir şekilde açıklanmıştır.
SLB-tabanlı deneyler yorumlarken bir zaman canlı bir hücrenin plazma zarının tüm özellikleri SLBs tarafından yer veriliyor tutmalı ve eksik nitelikleri bazı soruşturma altında fizyolojisini etkileyebilir söyledi. Sonuçta, SLB-gömülü proteinler serbestçe difüzyon ve hücresel meslektaşları çoğu 5,6,22 gibi membran mikro organize edilmez. Bir dereceye kadar canlı hücrelerin plazma zarı mimarisini muhafaza yapışık hücreler türetilen İmmobilize plazma zarı levhalar, başarılı bir şekilde B-lenfositleri 23 membran gömülü antijenlerden alımını incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte bu gibimembranlar son derece dinamik bir iskeleti ile etkileşim ve sert cam yüzeyin tarafından desteklenen hiçbir esneklik özelliği yoktur. Bu tutarsızlıkların ışığında ayarlanabilir esneklik yüzeyleri veya lokal olarak uygulanan ışık darbeleri yanıt olarak kendi katılık değiştirmek yüzeyleri tarafından desteklenen bir tanımlanmış moda proteinleri bölümlere yollarını sunmak ve mühendislik SLBs, ihtiyaç açıkça vardır.
The authors have nothing to disclose.
MA mali ve idari destek Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF, J3086-B11) ve bir teşekkür Schrödinger bursu Max-Planck-Toplum tarafından desteklenmiştir. GS Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF, LS13-030) tarafından desteklenmiştir. JH Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF, LS14-031) tarafından desteklenmiştir.
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |