Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Het begrijpen van de mechanismen waarmee membraaneiwitten aan hun cellulaire functie kan vaak een moeilijke taak, omdat hun werkingsmechanismen worden vaak door lage affiniteit interacties, die moeilijk te detecteren en evalueren conventionele biochemische methodologieën. Membraaneiwitten Voorts kan sterk verrijkt in specifieke membraandomeinen 5,6 of dynamische vormen hogere orde structuren, die in principe kunnen veranderen hun biologische activiteit 7.
Niet-invasieve laser-assisted enkel molecuul fluorescentie microscopie is dus de methode bij uitstek om eiwit gedrag in complexe cellulaire omgevingen onderzoeken geworden. Dit geldt met name voor de biochemische processen die plaatsvinden in het plasmamembraan, zoals deze kunnen in principe worden gecontroleerd geluidsarme totale interne reflectie (TIRF) modus. Hier sample belichting beperkt tot een maximaal 200 nm dunne plak in de nabijheid van een glazen suce, wat resulteert in een significant verlies van cellulaire achtergrond en, vanwege de kenmerken van het verdwijnende excitatielicht, ook in een aanzienlijke toename in fluorescentie signaalintensiteit 8,9. Beide aspecten zijn belangrijk bij het streven naar een hoge positie en tijdsresolutie in single molecule detectie.
Planar SLBs zijn niet alleen compatibel met TIRF microscopie. Wanneer gefunctionaliseerd met geschikte liganden ze ook directe toegang tot het bestuderen van de moleculaire dynamica van cel-cel erkenning als ze zich voordoen in immuuncellen of andere cellen. Ze kunnen ook alleen worden gebruikt voor beweeglijke en anderszins niet-hechtende cellen dicht genoeg bij het glaasje te positioneren zodat deze cellen kunnen worden afgebeeld in TIRF verlichting, hetgeen zeer wenselijk wanneer geleiding proeven met enkel molecuul volgen of single-moleculen gebaseerde superresolutie. Hiertoe eiwitten op een uiterst mobiel SLB worden geladen. Een inherent voordeel van de gebruikte li PIDs zijn dat er geen niet-specifieke binding van eiwitten helemaal. Bovendien kunnen SLBs als tweedimensionale vloeistoffen met een inherent vermogen om zichzelf te genezen worden beschouwd; onregelmatigheden in de glazen drager gecompenseerd tot een zekere mate. Een stapsgewijze protocol wordt aan zeer mobiele dubbellagen geladen met eiwitten van belang te genereren. De vorming van vlakke SLBs beschreven, waarbij 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) als hoofdbestanddeel (90-99%) en de synthetische bevatten en gefunctionaliseerd lipide 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3 – {[N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur] succinyl} nikkelzoutoplossing (DGS NTA-Ni) in geringe hoeveelheden (1-10%). POPC draagt een verzadigd vetzuur en een mono-onverzadigd vetzuur en vormt lipide dubbellagen hoge vloeibaarheid bij kamertemperatuur. DGS NTA-Ni bindt met een kopgroep poly-histidine staart en dient als anker voor poly-histidine-gemerkte eiwitten keuze (figuur 1).
"> Belangrijk is dat de microscopie hardware omvat een aantal randapparaten die hieronder worden beschreven. Met de ontvangen informatie en enige basiskennis optica en laserfysica moet elke bioloog kunnen een enkel molecuul beeldvorming setup bouwen. Sample excitatie idealiter uitgevoerd op een omgekeerde microscoop in Total Internal Reflection (TIRF) gebied aangezien dit regime minder vals licht en buitensporige achtergrond anderszins gevolg van cellulaire auto-fluorescentie 9. Hiervoor is een speciale TIRF geschikte objectief (zie hierna) en laser belichting nodig. Sommige experimenten zullen verlichting tijden vereisen binnen de milliseconde range en geëxploiteerd in snelle opeenvolging. Om de verlichting tijd te besparen of om onnodige bleken veroorzaakt door repeterende belichting is het vaak nuttig om het uitgezonden licht te splitsen in twee of meer spectrale kanalen te voorkomen. Dit zorgt voor gelijktijdige uitlezing twee of meer emissieprofielen, waarbij een belangrijke factor bij Conduc kan wordenTing experimenten met Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Hier de emissie van zelfstandige excitatie lichtpuls kan worden opgenomen zowel de FRET-donor en acceptor FRET (zoals gesensibiliseerde emissie). De camera moet genoeg fotonen te vangen met een voldoende lage achtergrond van enkele fluoroforen visualiseren tijdens de belichtingstijd. Computer software zal moeten worden tot de taak om excitatie sluiting en beeldacquisitie synchroniseren. Een volledig overzicht is hieronder en de figuur 2 gegeven:TIRF geschikte doelstelling: Voor doelstellingen gebaseerde TIRF verlichting de numerieke apertuur (NA) van het objectief moet gelijk zijn aan of groter dan 1,4 met standaard objectglaasjes zijn (n = 1,515) 9. Vergroting kan variëren van 60x tot 150x. Het doel moet chromatisch worden gecorrigeerd om voor confocaliteit wanneer beeldvorming verschillende fluoroforen.
Lasers: Het aantal beschikbare laser opties is sterk toegenomen in de afgelopen jaren. Modern elektronisch moduleerbare continue golf diode lasers zijn kostenefficiënt en kan worden bediend met een ongekende frequentie en snelheid. Duurdere gas ion lasers uitblinken in laserstraal kwaliteit, maar vereisen externe sluiting (zie hieronder) en vaak uitgebreide (water) koeling.
Excitatie luiken: akoestisch-optische modulators (AOM) zorgen voor een snelle sluiting in snelle opeenvolging 10. Voor strak sluiten van de combinatie van een AOM met mechanische luiken aanbevolen. Deze manier uitgebreide opwarming van de AOM als gevolg van continue blootstelling aan licht wordt vermeden en het licht lekt uit de AOM in de off-positie wordt opgeheven.
Lenzen worden gebruikt om laserstralen te verbreden en te concentreren op de achterkant brandvlak van het objectief. Zo het excitatielicht verlaat het objectief een parallelle bundel (figuur 3), die nodig is voor TIRF verlichting vanhet voorbeeld. Verplaatsen het brandpunt in de rug brandvlak van het centrum naar de periferie van het doel zal de hoek waaronder de bundel verlaat het doel te veranderen, maar niet de plaats van de laserspot op het monster (figuur 3), dat een functie van de totale bundelgeometrie. TIRF verlichting ontstaat een kritische hoek, die kan worden aangepast met behulp van een set van spiegels functioneren als een periscoop om het brandpunt van de laser te vertalen in het brandvlak van de doelstelling. Lenzen chromatisch moet worden gecorrigeerd en kunnen worden gebruikt in een combinatie van twee of drie lenzen. Een drie-lens bestaat uit twee lenzen als een telescoop op de laserstraal (en dus de lichtvlek op het monster) en een derde lens verbreden naar de verbrede focusseren in de achterkant brandvlak van het objectief (figuur 4). Beide functies (telescoop en concentreren) kan ook worden bereikt door een combinatie van twee lenzen (zie figuur 4).
<p class="jove_content"> Mirrors ten minste 95% reflecterend verlies van laserlicht vermijden. Voor elke bundel aanpassing een set van twee spiegels wordt meestal toegepast als zodanig arrangement is voldoende om elke hoek en de positie van een laserstraal precies passen.Dichroic overlays reflecteren en zenden licht van verschillende golflengten opgegeven en worden gebruikt om over elkaar of splitsing van de stralen van twee lasers.
Polychroic filters zijn complexer dan koudlichtfilters en zijn nodig om binnenkomende excitatie licht te reflecteren en doorgeven emissie licht het verlaten van het monster. Ze worden geplaatst in de filter kubus tussen het doel en de microscoop buis lens.
Ruim filters: Afhankelijk van het type laser employé d laser schoonmaken filters met een smalle transmissiebandbreedte in de laserstraal direct na de laser verlaat moet worden geplaatst.
Notchfilterszijn ontworpen om effectief te absorberen laserlicht met een smalle bandbreedte en zenden alle andere licht. Ze worden geplaatst in de uitstoot weg te filteren elke valse laserexcitatie licht. Echter, notch filters werken alleen bij 0 ° inkomende hoek. Als de bandbreedte van de inkeping filter is zeer scherp, de verschillende inkomende hoeken mag niet meer worden weerspiegeld. Blokkering van gecollimeerde laser laserlicht wordt niet beïnvloed, maar back-verstrooid licht kan niet efficiënt worden belemmerd van de camera bereiken.
Gemotoriseerde filter wielen uitgerust met de juiste filters wielen kunnen gemakkelijk worden geplaatst in de excitatie en emissie route en laat eenvoudig schakelen tussen verschillende lichtintensiteiten (wanneer uitgerust met ND filters) of TL-kanalen (wanneer geplaatst in de voorkant van een xenon of kwik booglamp voor ratiometrische calcium beeldvorming of voor de camera te selecteren voor de emitterende fluorofoor).
50:50 kubus straalsplitser cEen worden gebruikt om laserstralen gesplitst in twee afzonderlijke excitatiebundel paden en ook te combineren voor de periscoop.
Straalsplitser (emissie-pad): Voor snelle beeldacquisitie zonder enige noodzaak voor fysieke filter veranderingen, de uitstoot bundel wordt gesplitst in een blauw-verschoven en rode-verschoven kanaal. In principe kan beam splitters worden gebouwd door toepassing van een dichroïsche wig of een stel spiegels en een dichroïsche spiegel om de emissiebundel scheiden in een golflengte-afhankelijke wijze. Twee emissie filters zijn nodig om het schoonmaken van de uitgezonden kanalen.
Ruimtelijke filter: Ruimtelijke filtering van de excitatiebundel is soms nodig om niet evenwijdige lichtstralen uitgezonden van lage kwaliteit laserstralen verwijderen. Een ruimtelijk filter bestaat uit twee lenzen telescoop met een klein gaatje precies in het brandpunt van beide lenzen geplaatst. Zo vals licht als gevolg van niet-parallelle delen van de laserstraal wordt efficiënt geblokkeerd. Such voorwaarden moet worden voldaan bij de vaststelling van TIRF-gebaseerde microscopie. Ruimtelijke filtering toe met kleine gaatjes, die moeilijker te positioneren in het brandpunt en met kleinere focale lengten van de eerste lens. Om effecten van lensafwijkingen te verminderen is het voordelig zijn om in plaats van eenvoudige lenzen hoogwaardige en oneindig gecorrigeerde microscoopdoelstellingen met lage vergroting (10x of 20x).
Periscoop: een periscoop opstelling moeten de gefocusseerde laserbundel te vertalen in de achterkant brandvlak van het objectief, een voorwaarde voor TIRF beeldvorming. Het kan gemakkelijk worden opgebouwd uit twee twee-inch spiegels, een translationeel podium voor het instellen van de eerste spiegel en een post voor het positioneren van de tweede spiegel om de verbreed en geconcentreerd excitatie bundel in de microscoop (figuur 5) weerspiegelen.
Camera: Back-verlichte Electron-vermenigvuldigen Charge Coupled Devices (EMCCD) worden routinematig gebruikt voorde opname van de single molecule signalen. Dit is vanwege hun hoge kwantumrendement (tot 95%), hoge opnamesnelheid (tot 30 MHz) en relatief laag geluidsniveau. Afkoeling tot -80 ° C vermindert thermische ruis en wordt ondersteund door een aantal nog beschikbare EMCCD camera. Een beperking van de EMCCD technologie is dat cameraruis lineair toeneemt met zowel de camera versterking en het signaal wordt vastgelegd. Dit is niet het geval bij wetenschappelijke CMOS (sCMOS) camera's, die aanzienlijk goedkoper en werken door de speciale architectuur van de sCMOS chip veel sneller dan EMCCD camera. Maar een probleem in verband met de CMOS-technologie is dat het acquisitie heeft nog steeds een zekere mate van een kwantitatieve uitlezing op een enkel molecuul niveau, omdat elke pixel is voorzien van verschillende gevoeligheid. In principe kan dit worden gecompenseerd door middel pixel normaliseren, maar deze procedure niet gering 11. Dit is de reden waarom we nog steeds aarzelen om opnieuwlof sCMOS camera's voor single molecule microscopie, maar gezien de snelle ontwikkeling van deze technologie, kan sCMOS camera snel de camera gekozen worden. Langzame scan CCD-camera's te vermijden-versterking gerelateerde geluidsoverlast en pixel variantie allemaal samen en ondersteunen snelste acquisitie tarieven als ze in een zogenaamde 'kinetische' modus kan worden bediend. In deze stand de hele camera chip uitzondering van een gebied van belang (ROI) wordt gemaskeerd, waardoor het mogelijk is de chip zelf dienst als opslagapparaat. Nadat het ROI loopt voor het eerst worden de resulterende kosten verschoven naar het gemaskeerde gebied van de chip beeldpuntlijn pixel regel, waar het beeld is beschermd tegen verdere blootstelling aan licht. Zodra het verschuiven van alle lijnen van de ROI in het gemaskeerde gebied is voltooid (in het sub-milliseconden), de ROI zelf is klaar voor de volgende belichting. Deze cyclus wordt herhaald totdat alle pixellijnen van de CCD chip betalen. De chip wordt vervolgens uitgelezen langzaam sterk reduced uitlezing lawaai. Bijvoorbeeld op een 1000 x 1300 pixel chip, kan 20 ROI van 50×50 pixels worden opgenomen in snelle opeenvolging. Omdat de beelden op de chip geruime tijd blijven voordat ze uitgelezen, is het essentieel om hoogwaardige maskeren waarborgen en de camera afkoelen (bijvoorbeeld met vloeibare stikstof) als middel om buitensporige thermische ruis. Sommige EMCCD camera's ondersteunen ook de kinetische modus.
Software: Timing van de lasers, luiken, AOM's en belichting evenals de juiste opslag van beelden zijn een integraal onderdeel van een succesvolle beeldvorming experiment. In principe kan veel gedefinieerde bewerkingen worden geprogrammeerd met beschikbare software pakketten die komen met de camera. Commerciële softwarepakketten ondersteunen een groot aantal hardware randapparatuur, die met weinig technische kennis kan worden geïmplementeerd.
Pulse generator, Data Acquisition (DAQ) board (met analoge en digitale output kanalen) en oscilloscoop: Een pulsgenerator is eenuitstekende keuze om triggerpulsen omzetten in pulsen van bepaalde tijd en spanning. Zo lasers kan nauwkeurig worden gecontroleerd voor uitgangsvermogen en getimed in de milliseconde tot milliseconde range. DAQ borden met analoge uitgangen te bereiken hetzelfde en zijn eenvoudig te integreren in het moederbord van de computer via de PCI-slots. Pulsduur, amplitude en frequentie worden geverifieerd met een oscilloscoop.
Behuizing van de gehele excitatiebundel pad: Om fluctuaties in de excitatie profiel toe te schrijven aan de lucht convections het hele excitatiebundel pad moet worden afgesloten van zijn lab milieu te voorkomen. Deze maatregel is vooral van belang bij het uitvoeren van TIRF microscopie. Optische componenten worden ook beschermd tegen stof en het menselijk oog van laserlicht blootstelling. Behuizingen kunnen gemakkelijk bouwen van zwart karton, die kunnen worden gekocht in de kunst aanbod winkels.
Om de vloeibaarheid van de SLB Fluorescence Recovery Na Photobleac bepalenhing (FRAP) 12 metingen worden uitgevoerd. Voor FRAP het bestaan van twee excitatie bundelbanen raden (zie figuur 3). De eerste lichtbaan is ontworpen om fluorescentie beeld van de bilaag. Dit kan in TIRF configuratie met lage lichtintensiteit. De tweede stralengang moet het mogelijk maken een korte maar intense pulse bleekmiddel en dient non-TIRF modus worden geconfigureerd, zodat het doel verlaat langs de optische as. Een ronde opening kan in de excitatie stralengang geplaatst (zie figuur 8) om een perfect rond bleekmiddel profiel met gedefinieerde randen uitsteken. Om dit beeld opening op het object vliegtuig, zou de optimale positie in het brandvlak van lens 3 (zie figuur 3). Echter, vanwege de lange brandpuntsafstand van deze lens, een opening beeld van voldoende kwaliteit kan worden opgewekt, wanneer de opening is geplaatst op iets verschoven posities.
Na uitgevoerd tHij beeldvorming experiment de ruwe gegevens moeten adequaat worden geanalyseerd. Verscheidene stap voor stap protocollen worden aangeboden, waarbij de aanpassing van de hoofdinstellingen (bv lichtsterkte en tijd, TIRF hoek) omvatten, het verkrijgen en analyseren van de data.
Enkel molecuul microscopie biedt de unieke mogelijkheid om het gedrag van de eiwitten in hun eigen cellulaire omgeving bestuderen. Moleculaire beeldvorming wordt daarom steeds aantrekkelijker om een brede wetenschappelijke gemeenschap, maar veel leven wetenschappers nog steeds weg van de initiële investering in technologie en expertise verlegen. Het belangrijkste voordeel uit monteren eigen beeldvormingssysteem is dat het gemakkelijk kan worden aangepast aan de specifieke behoefte van iemand.
Zoals hier voorgesteld een niet-TIRF excitatiebundel kan eenvoudig worden geïmplementeerd naast een bestaand TIRF lichtpad als snelle en gedefinieerde foto-bleken (of -activation) fluoroforen en liganden wordt gewenst, bijvoorbeeld bij het uitvoeren FRAP of ligand uncaging experimenten 14 . De invoering van een emissie bundelsplitser maakt gelijktijdig opnemen van ten minste twee en in sommige gevallen tot vier fluorescente kanalen. De lijst met extensies is in wezen slechts beperkt doorde eigen verbeelding.
Bijvoorbeeld de uitvoering van een gemotoriseerde emissie-filter wiel in de emissie-pad zorgt voor snel schakelen tussen maximaal tien verschillende fluorescerende kanalen. Bij het combineren van twee gemotoriseerde emissiefilter wielen (elk voorzien van 10 filtersleuven) in serie, tot 18 fluorescerende kanalen kunnen worden uitgelezen. TIRF-gebaseerde beeldvorming kan worden aangevuld met metingen calcium mobilisatie en Interferentie Reflection Microscopie (IRM), na integratie van een Xenon of Mercury excitatielamp pad. IRM is de voorkeurswerkwijze voor de mate waarin de cellen worden gehecht aan het glasoppervlak of een SLB en kan derhalve een kritische informatie bij de interpretatie-gebaseerde TIRF imaging visualiseren. Vaststelling van een verwijd excitatie licht met behulp van een eenvoudige dichroïsche spiegel en een extra laser van 405 nm laat uitvoeren fotoactivatie lokalisatie microscopy (PALM) of stochastische reconstructie optische microscopie (STORM), namelijk twee superresolution methodologieën met een positienauwkeurigheid onder de diffractie limiet van zichtbaar licht 15,16.
Echter, experimentele succes is niet alleen een kwestie van de juiste hardware. Om optimaal te profiteren van geluidsarme-TIRF gebaseerde beeldvorming te nemen, moeten de cellen contact met een oppervlak op een manier die geen beperkingen oplegt op het celoppervlak of die interfereert met de fysiologie van hun plasmamembraan te maken. SLBs gefunctionaliseerd met geschikte eiwitten voor celadhesie overschrijdt goed geschikt voor dit doel, omdat alle SLB-ingebedde liganden lateraal mobiel en hun laterale positie binnen de bilaag te passen als reactie op binding en segregatie dynamiek receptor.
Om SLBs produceren in een reproduceerbare manier, is het het beste om te beginnen met een SUV van een hoge zuiverheid. Zoals hierin beschreven, is het dus essentieel om multilamellaire blaasjes, die ook geproduceerd tijdens sonicatie verwijderen twee ultracentrifugatie stappen die interfere met de vorming van aaneengesloten SLBs met hoge vloeibaarheid. SLBs hoogwaardige vorm alleen op schone glazen oppervlakken. Keer schoongemaakt glasplaatjes moet onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen in vacuüm. Belangrijk is dat SLBs nooit worden blootgesteld aan lucht omdat dit zou leiden tot de verstoring. SLB wassen omvat, zoals getoond, buffer spoelen met behulp van een serologische pipet, aangezien dit niet alleen een veilige maar ook tijdbesparende procedure.
Tijdens het oogsten en zuiveren van SLB-resident eiwitten het gebruik van detergenten worden vermeden. Dit komt omdat reinigingsmiddel mobiliteit eiwit aanzienlijk zal verminderen, zelfs indien aanwezig in kleine hoeveelheden. De behoefte aan reinigingsmiddel allemaal bij elkaar te omzeilen, is oplosbaar expressie van uitgescheiden polyhistidine-tag voorzien liganden aanbevolen in zoogdiercellen of insectencellen. Als hervouwing van E. coli inclusielichamen vereist, moet voorzichtigheid worden toegepast op detergentia effectief uit de inclusielichamen vóór de aan- en hervouwing verwijder.
Een belangrijk voordeel van het toepassen SLBs resultaten van modulaire en reconstitutive aard, waarmee specifiek ontleden de rol van een gegeven receptor-ligand interactie te celactivering en celadhesie. In dit verband is het belangrijk te vermelden dat DGS NTA-Ni aanwezig dient te zijn bij 10% binnen SLB om eiwitten concurreren om NTA-Ni bindingsplaatsen voorkomen. Bij toepassing SLBs herbergen slechts 1% of 2% DGS NTA-Ni, een vermindering van de associatie van een bepaalde polyhistidine gelabeld eiwit species kan worden opgemerkt, vooral wanneer co-incubatie van toenemende hoeveelheden van een tweede polyhistidine-gemerkt eiwit species (ongepubliceerd observatie). Dit fenomeen wordt niet waargenomen bij het werken met SLBs met 10% DGS NTA-Ni.
Hoewel we nooit waargenomen aspecifieke binding van elke polyhistidine-gemerkt eiwit getest SLBs die DGS NTA-Ni, moet deze mogelijkheid te testen bij de invoering van een eiwit voor het eerst,Daartoe adviseren wij het gebruik van SLBs verstoken van DGS NTA-Ni (het eiwit niet binden). Ten tweede, bij gebruik van een SLB met DGS NTA-Ni, het eiwit moet volledig uit te komen na het wassen van de SLB met PBS dat 300 mM imidazol.
Een ander belangrijk voordeel van het gebruik van SLBs is dat voorbijgaande interacties en signalering evenementen kunnen worden gecontroleerd met een verbeterde spatiotemporele resolutie 17-19. Dit is ten dele omdat een driedimensionale binding materieel is beperkt tot twee dimensies beeldvorming vooral bij het opnemen in geluidsgevoelige verzwakt TIRF modus. Het gebruik van SLBs is compatibel met single molecule signaaldetectie, een voorwaarde voor een foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) of stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), dwz superresolutiemicroscopie met een resolutie onder de diffractielimiet 15,16. Deze speciale beeldvormende modaliteiten staat enkel molecuul Förster Resonance Energy Transfer experimenten ontworpen om afzonderlijke eiwit-eiwit interacties visualiseren in een omgeving synaptische 20. Deze aanpak wordt in aanzienlijke detail in een Jove publicatie aangeduid als "Meten TCR-pMHC binding met behulp van een FRET-gebaseerde microscopie test" 21.
Bij de interpretatie van SLB-gebaseerde experimenten moet men altijd in gedachten houden dat niet alle eigenschappen van een plasma-membraan van een levende cel worden gekenmerkt door SLBs, en dat een deel van de ontbrekende kwaliteiten van de fysiologie in onderzoek kunnen beïnvloeden. Immers, SLB ingebedde eiwitten vrij diffunderen en niet membraan microdomeinen georganiseerd meeste van hun cellulaire tegenhangers 5,6,22. Geïmmobiliseerde plasmamembraan vellen afkomstig van hechtende cellen, waarbij de plasmamembraan architectuur van levende cellen in zekere mate behouden, zijn succesvol toegepast voor de opname van membraan verankerd antigenen op B-lymfocyten 23 bestuderen. Zelfs dergelijkemembranen geen interactie met een zeer dynamische cytoskelet en hebben geen flexibiliteit als ze worden ondersteund door een stijf glasoppervlak. Gezien deze verschillen is er duidelijk behoefte aan SLBs techniek, welke middelen bieden eiwitten hokjes in een gedefinieerde wijze en die worden ondersteund door oppervlakken aanpasbare flexibiliteit of oppervlakken die hun stevigheid in reactie op lokaal toegediende lichtpulsen veranderen.
The authors have nothing to disclose.
MA werd ondersteund door een Schrödinger gemeenschap van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, J3086-B11) en dankzij het Max-Planck-Maatschappij voor financiële en administratieve ondersteuning. GS werd gesteund door de Weense Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030). JH werd gesteund door de Weense Science and Technology Fund (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |