Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو شرط السريرية المدمرة التي تؤثر الحسية واللاإرادي وظائف SC. وغالبا ما تترك المرضى على قيد الحياة SCI مع المنهكة الشلل النصفي الذي يؤثر بشكل كبير على نشاطاتهم اليومية ونوعية الحياة 1. وكانت النماذج التجريبية SCI أداة لا غنى عنها في التحقيق العلمي لفهم الفيزيولوجيا المرضية لاصابات النخاع الشوكي وعمليات إصلاح العصبية المرتبطة بها. كما تم استخدام هذه النماذج لاختبار فعالية قبل السريرية لمختلف التدخلات اعصاب التجريبية التي تهدف إلى الانتعاش وظيفية. حاليا، معظم النماذج SCI في ممارسة توظف استخدام القوة الفظة المادية لتعطيل ميكانيكيا وتجرح SC. وتشمل هذه الأساليب كدمة، وضغط، والتفكك وtransection من SC 2. فقد قيل أنه بعد إهانة الميكانيكية الأولية لإصابة ثانوية في شكل مجموعات نقص التروية في في SC المصاب 3،4. المسببات لنقص التروية الثانوي ويشمل انحطاط واسعة الأنسجة، ونزف متني وأحيانا انسداد الأوعية الدموية بنسيج ذمة 5-7. نتيجة الإصابة الثانوية يتأثر سلامة SC أبعد من ذلك، يتم تخفيض قيمة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية بشدة في وظيفة وقدرتها على البقاء وتمر الخلايا مما يؤدي إلى احتشاء النمو خلال المرحلة المزمنة من الإصابة، مماثلة لنمو غبش الدماغية السكتة الدماغية التالية 8،9. وقد تم الإبلاغ عن العديد من الآليات مثل التحفيز الزائدة، إنتاج الجذور الحرة، والتهاب ليكون مسؤولا عن موت الخلايا الدماغية التالية SCI 10،11. بالإضافة إلى ذلك، SC نقص التروية هو من مضاعفات خطيرة من جراحات إصلاح الأبهر الصدري البطن التي غالبا ما تؤدي إلى الشلل النصفي في المرضى 12،13. على الرغم من هذا التأثير السريري عالية تتوفر حاليا نماذج قليلة جدا من نقص التروية الحبل الشوكي مع استنساخ عالية.
الإقليم الشمالي "> Photothrombosis (PT) هو طريقة تستخدم عادة للتحريض نقص التروية التنسيق في الدماغ 14-20. هذه التقنية إلى حد ما غير الغازية، استنساخه للغاية وتنتج الآفة الدماغية التنسيق الدقيق في المنطقة المكشوفة من الدماغ 17 -21. ويتحقق ذلك عن طريق الإدارة النظامية الأصباغ متفاعل مثل روز البنغال (RB) 16-20،22 أو erythrosine B 23 تليها تشعيع المترجمة من الأوعية الدموية مع مصدر ضوء مناسب. تنشيط ضوئي من الصبغة يتسبب في توليد الجذور الحرة التي تعطيل سلامة بطانة الأوعية الدموية على نحو سلس، وتتسبب في الصفائح الدموية لتتراكم، والتي تشكل في وقت لاحق الجلطة. وإعاقة تدفق الدم من خلال نتائج خثرة في احتشاء في المنطقة التي قدمتها السفينة 24. ونظرا لسهولة السيطرة على كثافة ومدة التشعيع هذا الإجراء غلة احتشاء موحد للغاية وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للحث على infarct في مختلف المواقع التشريحية تمكين المكاني (على سبيل المثال، المادة الرمادية مقابل المادة البيضاء) فهم تأثير نقص التروية.الهدف من الدراسة الحالية هو تطوير نموذج سهل وتكرار للغاية من SC نقص التروية في الفئران. وصفنا الداخلي للنموذج PT من SC نقص التروية في الفئران. أظهرت النتائج من الأنسجة والمناعية التي يمكن أن تحفز على نحو فعال PT SC احتشاء، وفقدان الخلايا العصبية ودباق رد الفعل.
في هذه الدراسة، وصفنا نموذجا photothrombotic من SC نقص التروية. بسبب التقدم في مجال الهندسة الوراثية وكانت هناك زيادة في الفئران المعدلة وراثيا المتاحة تجاريا التي جعلت من الممكن لدراسة تأثير جينات معينة تشارك في الفيزيولوجيا المرضية الدماغية في SC. وكان الهدف من هذ…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [منحة لا. R01NS069726] وجمعية القلب الأميركية في منح المعونة منحة [منحة لا. 13GRNT17020004] إلى SD.
Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |