Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos

Summary

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Abstract

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca²⁺ signaling using two-photon microscopy.

Introduction

Traumática lesão medular (LM) é uma condição clínica devastador que afeta as funções sensório-motoras e autonômicas do SC. Pacientes sobreviventes SCI muitas vezes são deixados com paraplegia debilitante que afeta significativamente suas atividades diárias e qualidade de vida ^1. Modelos Experimental SCI têm sido uma ferramenta indispensável na investigação científica para compreender a fisiopatologia da SCI e processos de reparação neural associados. Estes modelos também foram utilizados para testar a eficácia pré-clínica de diversas intervenções neuroprotectores experimentais que são destinadas a recuperação funcional. Atualmente, a maioria dos modelos SCI, na prática, empregar o uso da força física sem corte para perturbar e prejudicar o SC mecanicamente. Estes métodos incluem contusão, compressão, deslocamento e transecção do SC ^2. Tem sido sugerido que após o insulto mecânica primária uma lesão secundária sob a forma de conjuntos de isquemia no lesada no SC 3,4. A etiologia da isquemia secundária inclui extensa degeneração do tecido, hemorragia parenquimatosa e às vezes por obstrução de vasos sanguíneos por edema do tecido ^5-7. Como resultado da lesão secundária a integridade de SC é mais afectada, neurónios e células gliais são severamente prejudicada em função e viabilidade e sofrem apoptose que leva a um crescimento de infarto durante a fase crónica da lesão, análogo ao crescimento de penumbra de isquemia pós-AVC ^8,9. Vários mecanismos como excitotoxicidade, produção de radicais livres, e inflamação foram relatados para ser responsável pela morte celular isquémica após uma lesão medular ^10,11. Além disso, SC isquemia é uma complicação grave de cirurgias tóraco-abdominal do aneurisma da aorta, que muitas vezes levam a paraplegia nos pacientes ^12,13. Apesar de tão alto impacto clínico muito poucos modelos de isquemia medular com alta reprodutibilidade estão disponíveis no momento.

nt "> Indocianina (PT) é um método vulgarmente utilizado para a indução de isquemia focal no cérebro ^14-20. A técnica é relativamente não invasivo e altamente reprodutível e produz uma lesão isquémica focal exacta da área exposta do cérebro ^{17 -21.} Isto é conseguido por administração sistémica de corantes fotoactivos como Rose Bengal (RB) ou ^16-20,22 eritrosina B ²³ seguido por irradiação localizada de vasos sanguíneos com fonte de luz adequada. A fotoactivação do corante faz com que a geração de radicais livres que interromper a integridade do endotélio vascular liso, e fazer com que as plaquetas se acumulam, que subsequentemente forma um trombo. A obstrução do fluxo de sangue pelos resultados do trombo em um enfarte na região fornecido pelo vaso ^24. Devido à facilidade de controlo sobre o intensidade e da duração da irradiação este procedimento produz um enfarte altamente uniforme e reprodutível. Além disso, este método pode ser empregue para induzir um enfartet em várias posições anatómicas permitindo espacial (por exemplo, substância cinzenta vs matéria branca) compreensão do efeito da isquemia.

O objetivo do presente estudo é desenvolver um modelo fácil e altamente reprodutível de SC isquemia em ratinhos. Nós descrevemos o procedimento de um modelo PT de SC isquemia em ratinhos. Os resultados de histologia e imunocoloração demonstrou que a PT pode efectivamente induzir enfarte do SC, perda neuronal e gliose reactiva.

Protocol

Nota: Os ratinhos (C57BL / 6J, macho) envelhecido 10 – 12 semanas, foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pela Universidade de Missouri Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Pré-Surgery No dia antes da cirurgia autoclave e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos. Enrole os instrumentos e autoclave a 121 ° C a 15 p…

Representative Results

O objetivo deste estudo foi o de produzir isquemia medular em ratos usando um modelo PT. Após a região desejada do osso por cima da medula espinhal (T10 – T12) foi diluído, Rosa de Bengala foi injectado por via sinus retro-orbital, e a isquemia foi induzida pela PT A Figura 1A e B mostram o rato posicionado numa cirúrgico feito por encomenda. plataforma durante a cirurgia. O rato foi mantido no lugar por um grampo focinho e dois grampos vertebrado ajustável para estabilizar a coluna vertebral <stro…

Discussion

Neste estudo, descrevemos um modelo photothrombotic de SC isquemia. Devido aos avanços na engenharia genética, tem havido uma onda de camundongos transgênicos comercialmente disponível que tornou possível estudar o impacto de genes específicos envolvidos na fisiopatologia isquêmico no SC. O objectivo do estudo foi o de desenvolver um modelo reprodutível rato de isquemia medular. Aqui nós adaptamos um modelo cortical PT para induzir SCI em camundongos. No seguimento da cirurgia da coluna vertebr…

Materials

Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000	20 mg/ml in sterile saline
C57Bl6/J	Jackson lab	664	22-25g
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/ml
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	100 mg/ml
Betadine solution	Purdue	NDC-67618-150-01	10% povidone iodine topical solution
Normal saline	Abott Laboratories	04930-04-10	For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Ethanol	Decon labs.Inc	2716	70% ethanol for disinfection
Metal halide lamp	EXFO, Canada	X-Cite 120 PC	Set power at 12%
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-10	for minor dissection
Scissors (angled to side)	Fine Science Tool	14063-011	No. 3 handle
Standard scalpel	Fine Science Tool	10003-12	for removing muscle
Scalpel blade	Feather	2976	No. 10
Forceps (curved)	Fine Science Tool	11150-10	for holding tissue
Forceps (straight)	Fine Science Tool	11151-10	for holding tissue
Needle holder	Fine Science Tool	12002-12	for suturing
Tissue adhesive glue	3M Vetbond	1469SB	to adhere to edges of the cut skin
Monofilament polypropylene	USSC Sutures	VP-521	Size = 4-0 (for fascia)
Perma-hand silk	Ethicon	683G	Size = 4-0 (for skin)
Micro drill	Roboz Surgical Instrument Co. Inc.	RS-6300	with bone polishing drill bit
Laser doppler flowmeter	Moor Instruments	moorVMS-LDF1	for monitoring change in blood flow
Heating pad	Fine Science Tool	21052-00	to prevent hypothermia
Lab-Jack	Fisher scientific	14-673-50	4×4 in plate to adjust the height of the animal
X-Y gliding stage	Amscope	GT100	for positioning the animal under microscope