Photothrombosis-indotta ischemia focale come un modello di lesioni del midollo spinale nei topi
Summary
Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Abstract
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
Introduction
Traumatica lesioni del midollo spinale (SCI) è una condizione clinica devastante che colpisce le funzioni sensomotorie e autonome della SC. I pazienti che sopravvivono SCI sono spesso lasciati con debilitante paraplegia che colpisce in modo significativo le loro attività quotidiane e la qualità della vita 1. SCI modelli sperimentali sono stati uno strumento indispensabile per la ricerca scientifica per capire la fisiopatologia della SIC e processi di riparazione neurale associati. Questi modelli sono stati utilizzati anche per testare l'efficacia preclinica di vari interventi neuroprotettivi sperimentali che mirano a recupero funzionale. Attualmente, la maggior parte dei modelli di SCI, in pratica, impiegare l'uso della forza fisica contundente di interrompere meccanicamente e ferire la SC. Questi metodi includono contusione, la compressione, la dislocazione e recisione della SC 2. È stato suggerito che dopo l'insulto meccanico primario un danno secondario sotto forma di insiemi in ischemia nel SC lesa 3,4. L'eziologia di ischemia secondaria comprende una vasta degenerazione dei tessuti, emorragia parenchimale e talvolta da ostruzione dei vasi sanguigni da parte del tessuto edema 5-7. Come risultato della lesione secondaria l'integrità del SC è ulteriormente influenzata, neuroni e cellule gliali sono gravemente compromessa in funzione e vitalità e apoptosi che porta a infarto crescita durante la fase cronica di lesioni, analoga alla crescita della penombra ischemica ictus seguente 8,9. Diversi meccanismi come eccitotossicità, produzione di radicali liberi, e infiammazione sono stati segnalati per essere responsabile della morte cellulare ischemica seguente SCI 10,11. Inoltre, SC ischemia è una grave complicanza di toraco-aneurisma dell'aorta addominale ambulatori di riparazione che spesso portano a paraplegia nei pazienti 12,13. Nonostante così alto impatto clinico sono attualmente disponibili pochissimi modelli di ischemia del midollo spinale con elevata riproducibilità.
nt "> Photothrombosis (PT) è un metodo comunemente utilizzato per l'induzione di ischemia focale nel cervello 14-20. La tecnica è abbastanza non invasiva, altamente riproducibili e produce una precisa focale lesione ischemica sulla superficie esposta del cervello 17 -21. Ciò si ottiene con la somministrazione sistemica di coloranti fotoattivi come Rosa Bengala (RB) 16-20,22 o Eritrosina B 23 seguita da irradiazione localizzata di vasi sanguigni con sorgente luminosa corretta. Fotoattivazione del colorante provoca la generazione di radicali liberi che compromettere l'integrità dell'endotelio vascolare liscia, e causano le piastrine di accumulare, che forma successivamente un trombo. L'ostruzione del flusso di sangue dai risultati trombo in un infarto nella regione fornito dal recipiente 24. Grazie alla facilità di controllo della intensità e durata dell'irradiazione questa procedura produce un infarto molto uniforme e riproducibile. Inoltre, questo metodo può essere impiegato per indurre un infartot in varie sedi anatomiche abilitazione spaziale (ad esempio, materia grigia vs. materia bianca) comprensione degli effetti di ischemia.Lo scopo del presente studio è di sviluppare un modello semplice e altamente riproducibile di SC ischemia nei topi. Abbiamo descritto la procedura di un modello PT di SC ischemia nei topi. I risultati di istologia e immunostaining dimostrato che TP può effettivamente indurre SC miocardico, perdita neuronale e gliosi reattiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo descritto un modello photothrombotic di SC ischemia. Grazie ai progressi nel campo dell'ingegneria genetica si è registrato un aumento in commercio topi transgenici che ha reso possibile lo studio l'impatto di specifici geni coinvolti nella patofisiologia ischemico nel SC. Lo scopo dello studio è stato quello di sviluppare un modello riproducibile murino di ischemia del midollo spinale. Qui abbiamo adattato un modello corticale PT per indurre SCI nei topi. Dopo l'…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [di Grant no. R01NS069726] e l'American Heart Association Grant nel concedere aiuti [Concessione n. 13GRNT17020004] per SD.
Materials
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
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