Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) är en förödande kliniska tillstånd påverkar sensomotoriska och autonoma funktioner SC. Patienter överlevande SCI är ofta kvar med försvagande paraplegi som väsentligt påverkar deras dagliga aktiviteter och livskvalitet 1. Experimentell SCI modeller har varit ett oumbärligt verktyg i den vetenskapliga undersökning för att förstå patofysiologin av SCI och tillhörande neurala reparationsprocesser. Dessa modeller har också använts för att testa den prekliniska effekten av olika experimentella neuroprotektiva insatser som syftar till funktionell återhämtning. För närvarande majoriteten av SCI modeller i praktiken använda fysiskt trubbigt våld för att mekaniskt störa och skada SC. Dessa metoder innefattar kontusion, kompression, förskjutning och tran av SC 2. Det har föreslagits att efter den primära mekaniska förolämpning en sekundär skada i form av ischemi uppsättningar i i den skadade SC 3,4. Orsaken av sekundär ischemi inkluderar omfattande vävnadsdegeneration, parenkymal blödning och ibland genom obstruktion av blodkärl genom vävnadsödem 5-7. Som ett resultat av den sekundära skada integriteten hos SC påverkas vidare, är neuroner och gliaceller kraftigt nedsatt funktion och viabilitet och undergå apoptos, vilket leder till infarkt tillväxt under kroniskt stadium av skada, analogt med tillväxten av ischemisk halvskugga efter stroke 8,9. Flera mekanismer som excitotoxicitet, fria radikaler och inflammation har rapporterats vara ansvarig för ischemisk celldöd efter SCI 10,11. Dessutom, SC är ischemi en allvarlig komplikation vid bröst-bukaortaaneurysm reparation operationer som ofta leder till förlamning hos patienterna 12,13. Trots sådan hög klinisk effekt fåtal modeller av ryggmärgs ischemi med hög reproducerbarhet är för närvarande tillgängliga.
nt "> Photothrombosis (PT) är en vanligt använd metod för induktion av fokal ischemi i hjärnan 14-20. Tekniken är ganska icke-invasiv, mycket reproducerbar och producerar en exakt fokal ischemisk skada i det exponerade området av hjärnan 17 -21. Detta uppnås genom systemisk administrering av fotoaktiva färgämnen som Rose Bengal (RB) 16-20,22 eller erytrosin B 23 följt av lokaliserad bestrålning av blodkärl med ordentlig ljuskälla. Fotoaktivering av färgämnet orsakar genereringen av fria radikaler som störa integriteten hos den släta kärlendotel, och orsaka att blodplättarna att ackumulera, som därefter bildar en tromb. Den obstruktion av blodflödet genom att trombosen resulterar i en infarkt i regionen som tillhandahålls av kärlet 24. På grund av lätthet av kontroll på intensitet och bestrålningens varaktighet detta förfarande ger en mycket jämn och reproducerbar infarkt. Dessutom kan denna metod användas för att inducera en infarct på olika anatomiska platser som möjliggör spatial (t.ex. grå substans mot vita substansen) förståelse av effekten av ischemi.Syftet med den aktuella studien är att utveckla ett enkelt och mycket reproducerbar modell av SC-ischemi i möss. Vi beskrev förfarandet i en PT-modell av SC-ischemi i möss. Resultat från histologi och immunfärgning visade att PT effektivt kan inducera SC infarkt, neuronal förlust och reaktiv glios.
I denna studie har vi beskrivit en photothrombotic modell av SC-ischemi. På grund av framsteg inom genteknik har det skett ett uppsving i kommersiellt tillgängliga transgena möss som har gjort det möjligt att studera effekterna av specifika gener som är involverade i den ischemiska patofysiologi i SC. Syftet med studien var att utveckla en reproducerbar musmodell av ryggmärgsischemi. Här har vi anpassat en kortikal PT modell för att förmå SCI i möss. Efter kirurgi den bakre ryggrads venen och…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [Grant nr. R01NS069726] och American Heart Association Grant i stöd Grant [Grant nr. 13GRNT17020004] till SD.
Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |