Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

Comme l'offre mondiale de combustibles non renouvelables et de leurs produits déclins associés, les scientifiques ont mis au défi de créer des carburants et des produits chimiques similaires à partir de sources d'origine végétale ^1. Un aspect clé de ce travail est de déterminer quelles espèces de plantes peuvent être appropriés pour la production de biocarburants et des biomatériaux ^2,3. En général, ces matières premières sont évaluées pour la lignine, la cellulose, l'hémicellulose et la teneur en; ainsi que leur sensibilité à la déconstruction (récalcitrant) par un prétraitement thermique, mécanique et / ou chimique, avec ou sans saccharification enzymatique ultérieure. Des analyses plus détaillées sont utilisés pour déterminer la composition spécifique de la lignine et l'hémicellulose fractions ainsi que des activités enzymatiques optimales nécessaires. Les modifications transgéniques de plantes qui ne possèdent pas intrinsèquement traits idéales pour la conversion biochimique ou thermochimique aux produits souhaités ont fourni aux chercheurs une source considérablement élargi du potmatières premières tiels ^4. Les méthodes d'analyse standard pour quantifier les traits chimiques d'une plante, tout en étant très utile pour les petites séries d'échantillons, sont inadaptés pour le dépistage rapide de centaines ou de milliers d'échantillons ^5-7. Les procédés décrits ici HTP ont été développés pour évaluer rapidement et efficacement un grand nombre de variantes de la biomasse à des changements dans la paroi cellulaire récalcitrant à la dégradation thermochimique et / ou enzymatique.

Il est essentiel de comprendre que les essais de criblage HTP décrites ici n'a pas été conçu pour maximiser la conversion ou le rendement. L'objectif est de déterminer les différences relatives dans la résistance intrinsèque des échantillons de biomasse connexes. En conséquence, un grand nombre des étapes d'analyse diffèrent des essais de conversion de la biomasse «typiques», où l'objectif est d'obtenir des taux de conversion maximal ou étendue. Par exemple, sévérités prétraitement plus faibles et la réduction des temps d'hydrolyse enzymatique sont utilisés pour optimiser différerrences entre les échantillons. Dans la plupart des cas, des charges relativement élevées d'enzymes sont utilisés pour réduire des écarts dus à la variation expérimentale de l'activité de l'enzyme, ce qui pourrait fausser considérablement les résultats.

Des techniques rapides pour déterminer la composition des parois cellulaires végétales et les sucres monomères libérés suivante saccharification enzymatique comprend la robotique, personnalisés, des plaques à 96 puits thermochimique compatibles, et des modifications des méthodes de laboratoire standard ^8-11 et protocoles instrumentales, telles que la spectroscopie de vibration (infrarouge (IR), dans le proche infrarouge (NIR), ou Raman) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) ^{de 12 à 17.} Ces méthodologies sont essentiels pour isoler les matières premières à forte cellulose ou le contenu de lignine faible, ou ceux qui devraient donner le plus élevé de glucose, le xylose, l'éthanol, etc. Ces méthodes ont permis analyses à échelle réduite qui emploient de plus petites quantités de biomasse et de consommables, menant à des réductions dans experimental dépenses ¹⁸ </sjusqu'à>. Une autre caractéristique de cette approche méthodologique est que diverses conditions expérimentales peuvent être rapidement et, dans certains cas simultanément, évaluée. Par exemple, une variété de différentes stratégies de prétraitement ou cocktails d'enzymes peut être testé, permettant à des paramètres expérimentaux les plus optimales pour être rapidement identifiés et utilisés. Matières premières populaires, tels que les tiges de maïs ^9, le peuplier ^8,10, la bagasse de canne ^8, et le panic raide ⁸ ont été évaluées avec succès en utilisant ces méthodes de HTP.

Lignine totale et de la composition monomère lignine sont aussi communément quantifiés traits de la biomasse. Il a été démontré des réductions de la teneur en lignine pour augmenter la digestibilité enzymatique de polysaccharides ^19,20. Le rôle que le rapport monomère lignine (souvent signalé comme syringyl / guaiacyle (S / G) contenu) joue dans la déconstruction de la paroi cellulaire de la plante est toujours sous enquête. Certains rapports ont indiqué que les réductions dans le S / Grapport a conduit à une augmentation des rendements de glucose après hydrolyse ^21, tandis que d'autres études dévoilent la tendance inverse ^19,22. Procédés à haut débit pour l'évaluation de la lignine et de ses monomères comprennent la spectroscopie vibrationnelle (IR, NIR, Raman et ^{23 à 26)} couplée à une analyse multivariée, et la pyrolyse faisceau moléculaire par spectrométrie de masse (pyMBMS) ^27,28.

Lors de l'élaboration des méthodes de HTP pour le criblage de la biomasse, plusieurs considérations intégrales doivent être gardés à l'esprit. Un aspect clé est la complexité de la méthode. Quel est le niveau de compétence requis pour la technique? Analyses chimiométriques, par exemple, exigent des compétences spécifiques pour la construction, l'évaluation et le maintien de modèles prédictifs. Les méthodes standard présentent étapes indésirables d'analyse préparatoire ou des données ou utilisent des réactifs toxiques. Développement des modèles est un processus continu où de nouvelles données sont incorporées dans le modèle au fil du temps pour augmenter la robustesse du modèle. Un autre considration est les économies et une diminution des temps d'analyse expérimentale des méthodes à haut débit proposées. Si la méthode est très rapide, mais très coûteux, il peut ne pas être réalisable pour une technique de nombreux laboratoires à adopter. Les méthodes illustrées dans ce manuscrit sont des variantes des techniques normalisées, modifiés pour amplifier les capacités de débit. Ces protocoles mesurer quantitativement les traits de la biomasse d'intérêt sans nécessiter le développement de modèles prédictifs. Ceci est un attribut essentiel de ces techniques, car les méthodes de prévision, tout en présentant de fortes corrélations avec la norme analyses utilisé pour développer les modèles, ne sont pas aussi précis que la mesure effectivement la quantité d'intérêt pour les échantillons. Considérant que les méthodes utilisées sont essentiellement versions réduites de méthodes analytiques banc échelle standard, exactitude et la précision sont négociés pour la vitesse et le débit. Surtout, ce résultat est dû à des erreurs élevé dans les petites pipetage de volume et de pesage; ainsi que l'augmentation deamplement hétérogénéité taille de l'échantillon est réduite. Alors que les grandes séries d'échantillons peuvent être examinés et comparés, un grand soin doit être exercé en faisant des comparaisons entre les campagnes distinctes et aux résultats l'échelle du laboratoire.

La plupart des étapes fastidieuses impliquent la manipulation physique de la biomasse. Échantillons de broyage peut prendre plusieurs minutes par échantillon, y compris le nettoyage de l'usine entre les échantillons. Le chargement manuel, le déchargement, et les trémies de nettoyage et de remplissage et de vidange des sachets de thé et les sacs d'échantillons est également très intensive en main. Bien que chaque étape peut prendre une minute ou plus, faisant des milliers d'échantillons peuvent prendre plusieurs heures, voire des jours. Les robots peuvent charger une plaque de réacteur typique avec la biomasse dans environ 3 à 4 heures ou 6 à 8 plaques ^jour -1 robot de ^-1. Cette situation est fonction des paramètres de précision utilisées ainsi que le type et la quantité de biomasse à tester. Plateaux de remplissage du réacteur avec de l'eau, de l'acide dilué, ou enzymatique est effectué rapidement à l'aide d'un robot de manipulation de liquides. Pretraitement d'un empilement de plaques (de 1 à 20 des plaques de réacteur) prend entre 1 et 3 heures lorsque l'assemblage, refroidir, et le démontage est inclus. L'hydrolyse enzymatique prend 3 jours et l'analyse du sucre nécessite environ 1 h de temps de préparation ainsi que 10 minutes par plaque de réacteur pour terminer le test et lire les résultats. Un horaire hebdomadaire de prétraitement et d'analyse fixées jours accueille un horaire de travail raisonnable, minimisant impair heures et le week-end des efforts pour la composante humaine de l'essai et permet un traitement ~ 800 à 1000 échantillons par semaine sur une base continue. Le débit maximum dépend de plusieurs facteurs, notamment la quantité de matériel (robots, réacteurs plaques, etc.) et combien de "logiciel" (ie, la dotation en personnel) sont disponibles pour faire le travail manuel. La limite supérieure pratique est 2500 à 3000 échantillons / semaine; cependant, que la production nécessite l'opération 7 jours par semaine et plusieurs stagiaires étudiants et techniciens. En comparaison, 3000 échantillons par HPLC exigeraient environ 125 jours de samanalyse ple plus la main-d'œuvre supplémentaire de peser manuellement des échantillons dans des réacteurs et des échantillons de filtrage avant l'analyse.

Protocol

1. à haut débit détermination du glucose et du xylose rendements suivants enzymatique saccharification 9,29 Préparation de l'échantillon (Grincement, De-amidonnage, Extraction, prétraitement) Broyer au moins 300 mg de chaque échantillon de la biomasse en utilisant un broyeur Wiley, de telle sorte que les particules passent à travers un tamis 20 format (850 um). Transfert à l'anti-statiques zip-top sacs (généralement un code-barres) et de l'information de l'échan…

Representative Results

L'effet combiné de la pré-traitement thermochimique et la saccharification enzymatique ultérieure est mesurée en fonction de la masse de glucose et xylose libérée à la fin de l'essai. Les résultats sont rapportés en termes de milligrammes de glucose et xylose libérés par gramme de biomasse. Ceci est en contraste frappant avec les données déclarées à partir d'essais banc échelle, qui est généralement déclarés comme pour cent de rendement théorique basée sur l'analyse de la compositio…

Discussion

Les principales étapes de préparation d'échantillons pour obtenir des données précises et reproductibles lors de la conduite des expériences de criblage à haut débit sont les suivantes:

Sucre Essai de libération:

En général, les échantillons sont préparés en lots allant de quelques dizaines à plusieurs milliers à la fois. Chaque étape majeure est typiquement effectuée pour tous les échantillons avant de se déplacer vers l'avant afin de…

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494