リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
非再生可能燃料とその関連製品の下落のグローバルな供給として、科学者たちは、植物由来の源1から同様の燃料や化学物質を作成するために挑戦されています。この研究の重要な側面は、植物の種がバイオ燃料及びバイオマテリアル2,3の製造に適している可能性が決定されます。典型的には、これらの原料は、リグニン、セルロース、およびヘミセルロース含有量について評価されます。同様に、熱的、機械的、および/または化学的な前処理を経て解体（反抗）に対する感受性を持つか、その後の酵素糖化なし。より詳細な分析は、リグニンおよびヘミセルロース画分の特定の組成物、ならびに必要に応じて、最適な酵素活性を決定するために使用されます。本質的に希望する商品に生化学的または熱化学変換のための理想的な特性を持たない植物のトランスジェニック修正は鍋の大幅に拡張ソースで研究者に提供していますential原料4。小さ なサンプルセットのために非常に有用であるが、植物の化学的特性を定量化するための標準的な分析方法は、サンプル5-7の数百または数千の迅速なスクリーニングには不向きです。本明細書に記載のHTP法は、迅速かつ効率的に熱および/または酵素分解に細胞壁反抗の変化をバイオマス変異体の大きな番号を評価するために開発されてきました。
これは、HTPスクリーニングアッセイは、本明細書に記載の変換または収量を最大にするように設計されていないことを理解することが重要です。目的は、従来のバイオマス試料の固有の反抗の相対的差異を決定することです。その結果、分析ステップの多くは、目的の最大変換速度または程度を得ることである "典型的な"バイオマス変換アッセイ、異なります。例えば、下部前処理重大度および短い酵素加水分解時間は、異なる最大化するために使用されサンプル間ences。ほとんどの場合、比較的高い酵素負荷を大幅に結果をゆがめる可能性が酵素活性の実験的変動に起因する差異を減少させるために使用されます。
植物の細胞壁と単糖の組成を決定するための迅速な技術は、酵素糖化以下の遊離したロボット、カスタマイズされた、熱化学互換性の96ウェルプレート、および標準的な実験方法8-11や、振動分光法などの楽器のプロトコル（赤外線の変更が含まれます（IR）、近赤外線（NIR）、またはラマン）および核磁気共鳴（NMR）12-17。これらの方法論は、実験の削減につながる、高セルロース、低リグニン含量、または最高グルコース、キシロース、エタノールを得ることが予想される、 などが挙げられる。これらの方法は、バイオマスや消耗品の少量を採用するダウンスケールの分析を有効にしているとの供給原料を分離するための鍵です費用18 </s>アップ。この方法論的アプローチのもう一つの特徴は、種々の実験条件を迅速にすることができることであり、同時にいくつかの例では、評価しました。例えば、異なる前処理方針または酵素カクテルの様々な最適な実験パラメータを迅速に識別して使用することができるように、試験することができます。トウモロコシ茎葉9、ポプラ8,10、サトウキビバガス8、およびスイッチグラス8など人気の原料は、首尾よくこれらのHTP法を用いて評価されています。
総リグニンおよびリグニン単量体組成物はまた、一般的にバイオマスの特性を定量化します。リグニン含量の減少は、多糖類19,20の酵素消化を増加させることが示されています。 （多くの場合、シリン/グアイアシル（S / G）の含有量として報告される）リグニン単量体の比率は植物細胞壁の解体で果たす役割はまだ調査中です。一部のレポートは、S / Gでその削減を示しています他の研究は反対の傾向19,22を発表しながら、比は、加水分解21後に増加したグルコース収量につながりました。リグニンおよびそのモノマーを評価するためのハイスループット法は、振動多変量解析と結合された分光法（IR、NIR、およびラマン23-26）、および熱分解分子ビーム質量分析法（pyMBMS）27,28を含みます 。
バイオマスをスクリーニングするためのHTP法を開発する場合、いくつかの不可欠な考慮事項が念頭に置いておく必要があります。一つの重要な側面は、方法の複雑さです。技術に必要なスキルレベルとは何ですか？計量化学分析は、例えば、構築評価し、予測モデルを維持するための特定のスキルを必要とします。標準的な方法は、望ましくない、準備やデータ解析の手順を示すか、有毒な試薬を使用しています。モデルの開発は、新しいデータがモデルの堅牢性を高めるために時間をかけてモデルに組み込まれている継続的なプロセスです。別considerationはコスト削減であると提案された高スループット法の実験的な分析時間を減少させました。この方法は非常に迅速ですが、非常に高価である場合には、採用する多くのラボのための実現可能な技術ではないかもしれません。この原稿に示される方法は、スループット能力を増幅するように修正された標準化された技術の変異体です。これらのプロトコルは、定量的予測モデルの開発を必要とすることなく、興味のあるバイオマスの特性を測定します。 、モデルを開発するために使用される標準的な分析と強い相関を示すが、実際にサンプルに対する関心の量を測定するほど正確ではありませんしながら、予測方法以来、これらの技術の重要な属性です。使用方法は、基本的に、標準的なベンチスケールの分析方法のバージョンをスケールダウンしているのに対し、正確さと精度、速度とスループットのために取引されています。ほとんどの場合、この結果は、小容量のピペッティングおよび計量の上位エラーに起因するものです。同様の増加サンプルサイズとして十分な不均一性が低減されます。大規模なサンプルセットをスクリーニングし、比較することができますが、別個のキャンペーンの間とベンチスケールの結果との比較を行う際に、細心の注意を払わなければなりません。
最も時間のかかるステップは、バイオマスの物理的操作を必要とします。研削サンプルはサンプル間圧延機を掃除などのサンプルあたりのいくつかの分をとることができます。手動でアンロードをロードし、クリーニングホッパー、充填、ティーバッグやサンプルバッグを空にすることも非常に労働集約的です。各ステップは分以上かかる場合がありますが、数千のサンプルを実行すると、数時間または数日かかる場合があります。ロボットは約3〜4時間または6〜8プレート1日目ロボット-1にバイオマスと典型的な反応容器プレートをロードすることができます。この状況は、同様にテストされる種類、バイオマスの量として使用される精度パラメータに依存します。水を原子炉プレートを充填、希酸、または酵素を迅速に液体処理ロボットを使用して行われます。 Pプレートスタック（1〜20の原子炉プレート）の再治療は、アセンブリは、クールダウン時に1〜3時間がかかり、解体は含まれています。酵素加水分解は3日かかり、糖分析は、アッセイを完了し、結果を読み取るために準備時間の約1時間を加えた反応容器プレートあたり10分を必要とします。設定前処理と分析日の週間スケジュールは、継続的に週〜800〜1000のサンプルをアッセイの人間コンポーネントの奇数時間や週末の努力を最小限に抑え、合理的な作業スケジュールを収納して処理することができます。最大スループットは、主にどのくらいのハードウェア（ロボット、原子炉プレートなど ）、いくつかの要因に依存し、どのくらいの「ソフトウェア」（ すなわち 、人材派遣）マニュアル作業を行うことが可能です。実用的な上限は、2,500〜3,000サンプル/週です。しかし、その出力は、7日週の操作と複数の学生のインターンや技術を必要とします。比較では、HPLCによる3000サンプルは、SAMの約125日を必要とするであろうPLE分析に加えて、手動で分析前に反応器およびフィルタリングのサンプルにサンプルを計量の追加の労働。
Protocol
Representative Results
Discussion
次のようにハイスループットスクリーニング実験を行う際に、正確で再現性のあるデータを得るための重要なサンプル調製手順は次のとおりです。
シュガー放出アッセイ：
一般に、サンプルは、一度に、数十から数千の範囲のロットで製造されます。それぞれの主なステップは、典型的には、サンプル間の調製の変動を最小にするために前方に移動…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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