In vitro model af fysiologiske og patologiske Blood Flow med Application til Undersøgelser af vaskulær Cell Remodeling
Summary
Denne protokol replikater fysiologisk eller patologisk blodgennemstrømning in vitro for at hjælpe med at bestemme celle-respons ved sygdomstilstande patologier. Ved at indføre et tryk dæmpekammer nedstrøms for en blod pumpe, kan blodgennemstrømningen tværs vaskulaturen blive sammenfattet og pålægges et monolag af vaskulær endotel eller en mimetisk co-kultur.
Abstract
Vaskulær sygdom er en almindelig årsag til dødsfald i USA. Heri præsenterer vi en metode til at undersøge bidraget fra flow dynamik i retning af vaskulær sygdom patologier. Usunde arterier ofte til stede med væg afstivning, ardannelse, eller delvis stenose, som alle kan påvirke fluidstrømningshastigheder, og størrelsen af pulserende flow, eller pulsatility indeks. Replikation af forskellige strømningsforhold er resultatet af en tuning strømningstryk dæmpekammer nedstrøms for en blodpumpe. Indføring af luft i et lukket flow systemet giver mulighed for et sammentrykkeligt medium til at absorbere pulserende tryk fra pumpen og derfor variere i pulsatility index. Den heri beskrevne fremgangsmåde er simpelthen reproduceres, med meget styrbar input og let målelige resultater. Nogle begrænsninger er genskabelse af den komplekse fysiologiske puls bølgeform, som kun estimeres ved hjælp af systemet. Endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster og påvirkes af blodgennemstrømningen thrdybdegående arterien. Den dynamiske komponent i blodstrømmen bestemmes af minutvolumen og arteriel væg overholdelse. Vaskulær celle mekanisk-transduktion af flow dynamik kan udløse cytokinfrigivelse og krydstale mellem celletyper i arterien. Co-kultur af vaskulære celler er et mere nøjagtigt billede afspejler celle-celle interaktion på blodkarvæggen og vaskulær reaktion på mekanisk signalering. Bidrag strømningsdynamik, herunder cellens reaktion på de dynamiske og gennemsnit (eller stabil) komponenter af flow, er derfor en vigtig parameter ved bestemmelse sygdomspatologien og behandlingseffekt. Ved at indføre en de vitro co-kultur model og tryk dæmpning nedstrøms for blodpumpen som producerer simuleret minutvolumen, kan forskellige arteriel sygdom patologier undersøges.
Introduction
Sygelighed for hjerte-kar-sygdomme er den største i Amerika, med mange som følge af usund kar. Sunde arterier består af elastisk væv, med bløde luminale overflade belagt med et endotelcelle (EF) monolag. Arteriel flow kan modelleres som en oscillerende bølge funktion med positiv gennemsnitlig strømningshastighed. Den pulsatility index (PI) er kvotienten af oscillation størrelse og betyder flow (PI = (Max -. Min.) / Mean), 1 og er modelleret in vitro med variabel fartøj elasticitet 2 Arteriel elasticitet er vigtig i opbevaring af flow. energi fra hjertets sammentrækninger, dilatere under systolisk tryk, og spiller en væsentlig rolle i modulering blodgennemstrømningen PI. Fordi hjertet opretholder en ensartet, pulserende volumenstrøm, arteriel udvidelse øger tværsnitsareal, forbedre flow stabilitet ved at nedbringe strømningshastighed, forskydningsspænding, og PI. Hyppigt, usunde arterier tilstedeværende ændringer elasticiteteller overholdelse, viser afstivning fra vaskulær remodellering, arvæv eller forkalkning 3, 4. Derudover kan andre vaskulære lidelser, såsom neointimahyperplasi (NIH), 5 aneurisme og hypertension 6 og vaskulær fibrose 4, snøre kardiameter. Men nuværende medicinsk behandling og enhed behandling af vaskulære sygdomme ofte forsømmer betydningen af karvæggen compliance eller blod flow dynamik i vaskulær sygdom, der ofte kompliceres af ændringer i fartøj morfologi og egenskaber. Hverken ballonudvidelse eller stent besvare komplikation af muren elasticitet 7. Derfor in vitro modellering af blod strømme, som den arteriel sygdom og behandling er vigtig undersøgelse af sygdoms- patologier og fremtidige behandlingens effektivitet. Heri beskriver vi en fremgangsmåde til at replikere fysiologiske og patologiske blodgennemstrømning udformet til at bestemme celle respons i vaskulær sygdom Patholgier. Fluidstrømning forårsager forskydningsspænding på karvæggen, hvilket er en vigtig mekanisk signal i beholderen sundhed, påvirker alle celler i vaskulaturen. Adskillige mekaniske sensorer på det vaskulære endotel for fluid forskydning er blevet identificeret, herunder primære cilium vist i de seneste undersøgelser for endothelial mechanosensing 8. Endotelcelle aktivitet og morfologi påvirkes af strømningshastigheden, retning og Pulsatilitetsindeks. Derudover kan glatte muskelceller (SMC) migration blive påvirket af mekanisk-signaler med lav hastighed strømning gennem interstitiel væske 9, og kan også være gennem parakrin signalering fra endotelceller via deres reaktion på flow og mekanisk-transduktion af flow signaler via cytokin frigive 10. Den "dosis" afhængighed af den gennemsnitlige forskydning, PI og parakrin signalering kan også være indbyrdes afhængige. Med henblik herpå bestemmelse af vaskulær celle respons på væskeforskydning med varieret "dosering" i monolagskultureller co-kultur in vitro kunne give mekanistiske indsigt i vaskulær remodellering og forbedre sygdom og behandling forudsigelse. Strømmen, der anvendes i dette forsøg består af en blodpumpe, en opstrøms flow dæmpning luftbeholder, en nedstrøms flowmåler kun anvendes under forsøgsopstilling, en nedstrøms cellekultur, parallel-plade strømningskammeret og medier reservoir. Kontrol af vaskulære flow variabler såsom betyder strømningshastighed, slag i minuttet, og PI kan opnås ved at styre strømningshastigheden, pulsfrekvens, og indførelse af tryk dæmpning. Pulserende blod pumper kan leveres med variabel slaglængde deplacement på kontrolleret slag frekvens, der direkte vedrører betyde volumetriske strømningshastighed, og pulsfrekvens. Indførelse af en luft reservoir i strømningskredsløbet tillader trykket dæmpning, reducere strømning svingning størrelsesorden. Medier er en inkompressibel væske, medens luft i dæmpekammeret er komprimerbar, så overtryk fra strømmen bølge at væreabsorberes af luft kompression. Luften medier forholdet muliggør kontrol over, hvor meget dæmpning forekommer. En brugerdefineret cellekultur flow kammer 75 mm i længden med 50 mm i bredden blev skabt af akryl. Flow kommer ind gennem indløbsporten, og udvider gennem indsugningsmanifolden, giver ensartet strømning på tværs af hele det strømningskammeret. Lignende flow og strukturer er til stede ved kammerets udtag. Celler podes på funktionaliserede slides og efterfølgende fastgjort til strømningskammeret. Dette giver mulighed for store populationer, nemt hentes efter undersøgelsen. Co-kultur eksperimenter kan anvende en porøs polycarbonatmembran at fjerne celle-til-celle-kontakt mellem kulturer samtidig med at cytokin / flow transport. Dette system er tidligere blevet anvendt til at modellere høj PI flow og dens virkning på endotelmonolaget kultur og EF / SMC co-kultur 1, 10, for at undersøge celle respons på patologisk høj PI sygdom. Ved at beskrive den protokol, der bruges til at modellere disse flow conbetingelser, håber vi at hjælpe andre i fastlæggelsen strømningssignal bidrag til celle respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at reproducere pulserende flow in vitro, og kan være medvirkende første trin i bestemmelsen bidrag strømningsforhold til sygdom patologier. Tidligere undersøgelser ved hjælp af denne protokol har fundet strømningsforhold bidrager til vaskulær inflammatorisk reaktion. 1, 10 Desuden er denne protokol er beregnet til erfarne laboratorier. Som sådan, hverken i dybden fluidmekanik, eller biokemisk analyse er beskrevet heri. For mere avancerede fluid d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at anerkende finansieringskilder, herunder AHA (13GRNT16990019 til WT) og NHLBI (HL097246 og HL119371 til WT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
