혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름
Summary
이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.
Abstract
혈관 질환은 미국 내 사망의 흔한 원인이다. 여기서, 우리는 혈관 질환의 병리 향해 유동 역학의 기여를 조사하는 방법을 제시한다. 보강 벽, 흉터, 또는 모든 유체의 유량에 영향을 미칠 수있는 부분 협착증 및 유량 맥동의 크기, 또는 박동성 지수 종종 본 해로운 동맥. 다양한 유동 조건의 복제는 혈액 펌프의 하류 챔버 댐핑 유동 압력 조정의 결과이다. 압축성 매체 펌프로부터의 압력 맥동을 흡수하므로 박동 지수를 변화시키기 위해 닫힌 유동 시스템 내에서 공기의 도입은 허용한다. 본원에 기술 된 방법은 매우 간단하게 제어 가능한 입력하고 쉽게 측정 결과와 함께 재생된다. 몇 가지 제한 사항은 시스템에 의해 근사 복잡한 생리 펄스 파형, 레크리에이션이다. 내피 세포, 평활근 세포, 섬유 아세포 및 혈류 THR 의해 영향동맥을 깨닫지 못하고 있거나 남의. 혈류의 다이내믹 성분은 심 박출량 및 동맥벽의 준수에 의해 결정된다. 유동 역학의 혈관 세포 – 기계 전달은 사이토 카인의 방출과 동맥 내 세포 유형 사이의 크로스 토크를 트리거 할 수 있습니다. 혈관 세포의 공 배양은 혈관벽과 혈관 기계적 시그널링 응답에 대한보다 정확한 그림 반사 세포 – 세포 상호 작용이다. 흐름의 동적 및 평균 (또는 정상) 성분 세포 반응을 포함 유동 역학의 기여는, 따라서 질병 병리 및 치료 효능을 결정하는 중요한 메트릭이다. 시험 관내 공동 배양 모델을 도입하고, 압력 모의 심 박출량을 생성 혈액 펌프의 하류 댐핑 통해, 각종 동맥 질환의 병리 상태를 조사 할 수있다.
Introduction
심혈관 질환의 이환율은 많은 사람들이 건강에 해로운 혈관의 결과로, 미국에서 가장 큰 있습니다. 건강한 동맥 내피 세포 (EC) 단일 층으로 코팅 된 소프트 내강 표면과, 탄성 조직으로 구성되어 있습니다. 동맥 흐름 긍정적 평균 유량을 갖는 진동 파 함수로서 모델링 될 수있다. 박동 지수 (PI)는 진동 크기의 몫과 평균 흐름 (.. (PI) = (최대 – 최소) / 평균)이며, 1 변수 혈관 탄성과 함께 체외에서 모델링 된 2 동맥의 탄력이 흐름의 저장에 중요하다. 심장 수축으로부터 에너지 수축기 압력으로 확장시키고,과 혈류를 PI 조절에 중요한 역할을한다. 심장 일관 박동성, 체적 유량을 유지하기 때문에, 동맥의 확장은 혈류 속도, 전단 응력, 및 PI의 흐름을 감소시킴으로써 안정성을 향상 단면적을 증가시킨다. 탄성에 자주, 건강에 해로운 동맥 본 변경또는 규정 준수, 혈관 재, 흉터 조직 또는 석회화 3, 4에서 보강 표시. 또한, 이러한 신생 내막 증식증 (NIH), 5 (6) 동맥류, 고혈압 및 혈관 섬유증 4와 같은 다른 혈관 질환은 혈관 직경을 수축 할 수있다. 그러나, 현재의 약물 치료 및 혈관 질환의 치료 장치들은 종종 용기의 형태 및 성질의 변화에 의해 복잡 혈관 질환에서 혈관 벽 컴플라이언스 또는 혈류 역학의 중요성을 무시. 어느 풍선 혈관 성형술이나 스텐트 벽 탄성 (7)의 합병증에 응답합니다. 따라서, 혈액의 체외 모델링 동맥 질환과 치료에 의한 흐름은 질병의 병리와 치료의 미래 효능을 조사하는 것이 중요하다. 여기서, 우리는 혈관 질환 pathol에서 세포 반응을 판정하기위한 생리 학적 및 병리학 적 혈류를 복제하는 방법을 서술프라 이즈. 유체 유동은 혈관 내의 모든 셀에 영향을주는, 혈관 건강에 중요한 기계적 신호 혈관벽에서 전단 응력을 야기한다. 유체 전단의 혈관 내피 세포에 여러 기계적 센서는 내피 8 mechanosensing에 대한 최근의 연구에서 보여 주 섬모를 포함, 확인되었습니다. 내피 세포 활성 및 형태는 유속, 방향 및 박동에 의해 영향을 받는다. 또한 평활근 세포 (SMC) 마이그레이션 간질 액 (9)을 통해 저속 유동 – 기계 신호에 의해 영향을받을 수 있고, 또한 유동 및 사이토킨 통해 유동 신호 – 기계 형질 그들의 응답을 통해 내피 세포로부터의 분비 신호를 통해 할 수있다 (10)를 놓습니다. 평균 전단, PI 및 분비 신호의 "용량"의존은 상호 의존적 일 수있다. 단층 문화에서이 끝, 다양한 "투여"와 유체 전단에 혈관 세포 반응의 결정에또는 생체 외에서 공동 배양은 혈관 재에 역학적 통찰력을 제공하고, 질병 및 치료의 예측을 개선 할 수있다. 이 실험에 사용 된 유동 시스템은 혈액 펌프, 상류 흐름 댐핑 공기 저장소 만 실험 장치, 하류 세포 배양, 평행 평판 유동 챔버, 및 미디어 저장 기 동안 사용 하류 유량계로 구성된다. , 유속 의미 같은 혈관 흐름의 제어 변수는 분당 비트 및 PI는 제어 유량, 펄스 주파수, 압력 도입 댐핑을 통해 달성 될 수있다. 박동성 혈액 펌프는 체적 유량, 및 펄스 주파수를 의미하는 직접 관련 제어 스트로크 주파수에서, 가변 스트로크 변위 가능하다. 흐름 회로 내의 공기 저장소의 도입 유량 진동 크기를 감소 압력 댐핑을 허용한다. 댐핑 챔버 내의 공기가 유동 될 파의 과도한 압력을 허용하면서 압축 가능 매체는 비압축성 유체압축 공기에 의해 흡수. 미디어 비율 공기는 많은 감쇠가 발생하는 방식을 제어 할 수 있습니다. 폭 50mm로 길이가 75mm 사용자 정의 세포 배양 흐름 챔버는 아크릴로 만들어졌습니다. 흐름은 유입구를 통해 유입 및 유동 챔버의 전체에 걸쳐 일관된 유동을 제공하는 입구 매니 폴드를 통해 확장된다. 유사한 흐름과 구조는 챔버 출구에 존재한다. 세포가 기능화 된 슬라이드 상에 접종하고,이어서 유동 챔버에 부착된다. 이것은 쉽게 연구 한 후 검색된 큰 인구 수 있습니다. 공동 배양 실험 사이토킨 / 플로우 전송을 허용하면서 문화 간의 세포 간 접촉을 제거하는 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용할 수있다. 이 시스템은 이전에, 높은 PI 흐름 및 내피 단층 배양 및 EC / SMC 공동 배양 1, 10에 미치는 영향을 모델링하기 위해 세포 반응에 병리학 PI 높은 질환을 조사하는데 사용되었다. 이러한 플로우 콘을 모델링하는 데 사용되는 프로토콜을 기술함으로써ditions, 우리는 응답을 셀에 흐름 신호 기여를 결정하는 다른 사람을 도울 수 있도록 노력하겠습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 시험관 내에서 맥동 흐름을 재생하는 방법을 설명하고, 질환 병리에 유동 조건의 기여도를 결정하는 수단이 최초의 단계가 될 수도있다. 이 프로토콜을 사용하여 이전의 연구는이 프로토콜을 경험 연구소를 대상으로, 유동 조건은 또한 혈관 염증 반응. 1, 10에 기여 발견했다. 이와 같이, 어느 깊이 유체 역학 않으며 생화학 분석은 본원에 기재되어있다. 고급 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 (중량 HL097246 및 HL119371) AHA (중량 13GRNT16990019) 및 NHLBI을 포함하여 자금 출처를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
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