במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם
Summary
פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות משותפת כוזב.
Abstract
מחלת כלי דם היא סיבה שכיחה למוות בארצות הברית. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לבחון את התרומה של זרימת דינמיקה לקראת פתולוגיות מחלת כלי דם. עורקים בריאים לעתים קרובות נוכחי עם קיר התקשות, צלקות, או היצרות חלקית אשר עשוי להשפיע על כל שיעורי זרימת נוזל, ואת הגודל של זרימה פועמת, או מדד pulsatility. שכפול של תנאי זרימה שונים הוא התוצאה של כוונון לחץ זרימת דעיכת קאמרית במורד הזרם של משאבת דם. מבוא של אוויר בתוך מערכת זרימה סגורה מאפשר למדיום דחיסה לספוג לחץ פועם מהמשאבה, ולכן משתנה מדד pulsatility. השיטה המתוארת במסמך זה היא פשוט לשכפל, עם קלט השליטה ביותר, ותוצאות ניתן למדוד בקלות. מגבלות מסוימות הן בילוי של צורת גל המורכבת הפיזיולוגית הדופק, שנאמד רק על ידי המערכת. תאי אנדותל, תאי שריר חלק, ופיברובלסטים מושפעים זרימת דם through העורק. הרכיב הדינמי של זרימת דם נקבע על ידי עמידת פלט ודפנות העורקים של הלב. mechano-התמרה תא כלי דם של זרימת דינמיקה עלולה לעורר שחרור ציטוקינים והצטלבות בין סוגי תאים בתוך העורק. שיתוף התרבות של תאי כלי דם היא אינטראקציה תאי תאי תמונה המשקפת מדויקת יותר על קיר כלי דם ותגובת כלי דם לאיתות מכאנית. תרומה של זרימת דינמיקה, כולל תגובת התא למרכיבים הדינמיים וממוצעים (או יציבים) של זרימה, ולכן מדד חשוב בקביעת פתולוגיה מחלה ויעילות טיפול. באמצעות החדרת מודל שיתוף תרבות במבחנה ולחץ דעיכת במורד הזרם של משאבת דם אשר מייצרת תפוקת לב מדומה, פתולוגיות מחלת עורקים שונות עשויים להיחקר.
Introduction
שיעורי תחלואה במחלות לב וכלי דם הם הגדולים ביותר באמריקה, עם רבים כתוצאה מכלי דם בריאים. עורקים בריאים מורכבים של רקמה אלסטית, עם משטח luminal רך מצופה monolayer תא האנדותל (EC). זרימה בעורקים עשויה להיות מודל כפונקצית גל נדנוד עם שיעור זרימה ממוצע חיובי. מדד pulsatility (PI) הוא המנה של גודל תנודה ואומר זרימה (PI = (מקס -.. מינ ') / Mean), 1 וכבר דגם במבחנה עם גמישות כלי משתנה 2 גמישות עורקים חשובה באחסון של זרימה. אנרגיה מהתכווצויות לב, מתרחב בלחץ הסיסטולי, וממלא תפקיד משמעותי בויסות זרימת דם לצרכן. כי הלב שומר עקבי, pulsatile, זרימת נפחית, הרחבת עורקים מגבירה שטח חתך, שיפור זרימת יציבות על ידי הקטנת מהירות זרימה, מאמץ גזירה, וצרכן. לעתים קרובות, שינויי עורקים בריאים נוכחי לגמישותאו עמידה, בו מוצגות התקשות משיפוץ כלי דם, רקמת צלקת או הסתיידות 3, 4. בנוסף, הפרעות אחרות של כלי דם, כגון היפרפלזיה neointimal (NIH), 5 מפרצת ויתר לחץ דם 6 וסיסטיק כלי דם 4, עלולות להצר קוטר כלי. עם זאת, טיפול תרופתי וטיפול הנוכחי של מכשיר מחלות כלי דם לעתים קרובות להזניח את החשיבות של דינמיקת קיר כלי עמידה או זרימת דם במחלת כלי דם שמסתבכת לעתים קרובות על ידי שינויים במורפולוגיה כלי ונכסים. לא אנגיופלסטיקה הבלון ולא תומכן לענות הסיבוך של קיר גמישות 7. לכן, דוגמנות במבחנה של דם זורמת כתוצאה ממחלת עורקים וטיפולים חשובה בחקירת פתולוגיות מחלה ויעילות של טיפול בעתיד. בזאת, אנו מתארים שיטה של שכפול זרימת דם פיזיולוגית ופתולוגיים שנועדה לקבוע את תגובת תא בpathol מחלת כלי דםogies. זרימת נוזל גורמת ללחץ גזירה בקיר הכלי, שהוא אות מכאנית חשובה בבריאות כלי שיט, המשפיע על כל התאים בתוך כלי הדם. כמה חיישנים מכאניים על האנדותל של כלי הדם לגזירת נוזל זוהו, כולל cilium העיקרי שמוצג במחקרים שנעשה לאחרונה לאנדותל mechanosensing 8. פעילות תאי האנדותל ומורפולוגיה מושפעות מהירות זרימה, כיוון, וpulsatility. בנוסף, תא שריר חלק הגירה (SMC) יכולה להיות מושפעת על ידי mechano-אותות של מהירות זרימה נמוכה עד 9 נוזל ביניים, וגם יכולה להיות דרך האיתות אוטוקריני מתאי האנדותל באמצעות תגובתם לזרום וmechano-התמרה של זרימת אותות באמצעות ציטוקינים לשחרר 10. תלות "המנה" של גזירה ממוצעת, PI, ואיתות אוטוקריני יכולה להיות גם תלות הדדית. לשם כך, קביעת תגובת תא כלי דם לגזירת נוזל עם "מינון" מגוון בתרבות monolayerאו שיתוף התרבות במבחנה יכולה לספק תובנות מכניסטית לשיפוץ כלי דם ולשפר את המחלה וחיזוי טיפול. מערכת הזרימה השתמשה בניסוי זה מורכב ממשאבת דם, מאגר אוויר זרימת דעיכת במעלה הזרם, מד זרימה במורד הזרם משמש רק במהלך התקנה ניסיונית, תרבית תאים במורד הזרם, תא זרימת לוחות מקבילים, ומאגר המדיה. בקרת הזרימה משתנה כלי דם כגון מתכוונים קצב זרימה, פעימות לדקה, וPI יכול להיות מושגת באמצעות קצב זרימת שליטה, תדירות דופק, והכנסה של לחץ דעיכת. משאבות דם פועמות זמינות עם עקירת שבץ משתנה, בתדירות שבץ מבוקרת, הנוגעות ישירות לאומרים קצב זרימת נפחית, ותדירות דופק. מבוא של מאגר אוויר בתוך זרימת המעגל מאפשר לדעיכת לחץ, צמצום גודל זרימת תנודה. תקשורת היא נוזל בלתי דחיס, בעוד אוויר בתוך חדר דעיכת הוא דחיסה, המאפשר לחץ עודף מזרימת הגל להיותנקלט על ידי דחיסת אוויר. האוויר ליחס תקשורת מאפשר שליטה על כמה דעיכת מתרחשת. תא זרימת תרבית תאים מותאם אישית 75 מ"מ באורך של 50 מ"מ ברוחב נוצר מאקריליק. הזרימה נכנסה דרך נמל הכניסה, ומרחיבה דרך סעפת היניקה, מתן זרימה עקבית בשלמות של תא הזרימה. זרימה ומבנים דומים נמצאות בתא שקע. תאים הם זורעים על גבי שקופיות פונקציונליות, ולאחר מכן מחובר לתא הזרימה. זה מאפשר לאוכלוסיות גדולות, לקח בקלות לאחר המחקר. ניסויי שיתוף התרבות יכולים להשתמש בקרום פוליקרבונט נקבובי לחסל מגע תא אל התא בין תרבויות, ובמקביל לאפשר ציטוקינים / זרימת תחבורה. מערכת זו בעבר שימשה מודל זרימה הגבוה PI והשפעתו על תרבות monolayer האנדותל ושיתוף תרבות EC / SMC 1, 10, לחקור תא תגובה למחלה לצרכן גבוהה פתולוגית. בתיאור הפרוטוקול המשמש למודל הזרימה קון אלהditions, אנו מקווים לסייע לאחרים בקביעת תרומת זרימת אות לתא תגובה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה של שכפול זרימה פועמת במבחנה, ועשוי להיות צעד ראשון סייע בקביעת תרומה של תנאי זרימה לפתולוגיות מחלה. המחקרים קודמים תוך שימוש בפרוטוקול זה מצאו תנאי זרימה לתרום לתגובה דלקתית בכלי הדם. 1, 10 בנוסף, פרוטוקול זה מיועד למעבדות מנוסים. ככזה, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות מקורות מימון, ובכלל זה AHA (13GRNT16990019 לWT) וNHLBI (HL097246 וHL119371 לWT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
