Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare
Summary
Questo protocollo replica fisiologica o patologica flusso di sangue in vitro per aiutare a determinare la risposta cellulare in patologie malattia. Introducendo una pressione camera di smorzamento a valle di una pompa per il sangue, il flusso di sangue attraverso il sistema vascolare può essere riassunta e imposto un monostrato di endotelio vascolare o un co-coltura mimetica.
Abstract
Malattia vascolare è una comune causa di morte negli Stati Uniti. Qui, vi presentiamo un metodo per esaminare il contributo della dinamica dei flussi verso patologie malattia vascolare. Arterie malsane spesso si presentano con irrigidimento della parete, cicatrici, o stenosi parziale, che possono influenzare tutte le portate di fluido, e l'entità del flusso pulsatile, o indice di pulsatilità. La replica di varie condizioni di flusso è il risultato di una pressione sintonizzazione flusso smorzamento camera a valle di una pompa di sangue. Introduzione di aria all'interno di un sistema di flusso chiuso permette un mezzo comprimibile per assorbire la pressione pulsatile dalla pompa, e quindi variare l'indice di pulsatilità. Il metodo qui descritto è semplicemente riprodotto, con il contributo altamente controllabile, e risultati facilmente misurabili. Alcune limitazioni sono ricreazione del complesso forma d'onda impulsiva fisiologica, che viene approssimata dal sistema. Le cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e fibroblasti sono influenzati dal flusso sanguigno through l'arteria. La componente dinamica del flusso di sangue è determinata dall'uscita e parete arteriosa rispetto cardiaca. Vascolare cellule meccano-trasduzione di dinamiche di flusso può innescare il rilascio di citochine e cross-talk tra i tipi di cellule all'interno dell'arteria. Co-coltura di cellule vascolari è un'immagine che riflette più precisa interazione cellula-cellula sulla parete del vaso sanguigno e risposta vascolare alla segnalazione meccanica. Contributo della dinamica di flusso, compresa la risposta cellulare ai componenti dinamici e medi (o costante) di flusso, è quindi un parametro importante nel determinare la patologia della malattia e l'efficacia del trattamento. Attraverso l'introduzione di un modello di co-coltura in vitro e la pressione di smorzamento a valle della pompa sangue che produce un output cardiaco simulato, varie patologie malattia arteriosa possono essere esaminati.
Introduction
Tassi di morbilità per le malattie cardiovascolari sono la più grande in America, con molti derivante dalla vascolarizzazione malsano. Arterie sane sono costituiti da tessuto elastico, con morbida superficie luminale rivestita con cellule endoteliali (CE) monostrato. Flusso arterioso può essere modellato come una funzione d'onda oscillante con positivo portata media. L'indice di pulsatilità (PI) è il quoziente di oscillazione grandezza e media portata (PI = (Max -. Min.) / Medio), 1 ed è stato modellato in vitro con elasticità nave variabile 2 elasticità arteriosa è importante per lo stoccaggio del flusso. energia da contrazioni del cuore, dilatando sotto pressione sistolica, e svolge un ruolo importante nella modulazione del flusso sanguigno PI. Poiché il cuore mantiene una costante, pulsatile, flusso volumetrico, espansione arteriosa aumenta l'area della sezione trasversale, migliorando la stabilità del flusso, riducendo la velocità di flusso, shear stress, e PI. Frequentemente, arterie malsane presenti modifiche elasticitào la conformità, la visualizzazione di irrigidimento da rimodellamento vascolare, tessuto cicatriziale o calcificazioni 3, 4. Inoltre, altri disturbi vascolari, come l'iperplasia neointimale (NIH), 5 aneurisma e ipertensione 6 e fibrosi vascolare 4, possono costringere diametro del vaso. Tuttavia, il trattamento farmacologico attuale e il trattamento delle malattie vascolari dispositivo spesso trascurano l'importanza della compliance parete del serbatoio o il flusso di sangue dinamiche in malattia vascolare che è spesso complicato dai cambiamenti nella morfologia e le proprietà vaso. Né angioplastica né stenting rispondere alla complicazione del muro elasticità 7. Pertanto, la modellazione in vitro di sangue flussi derivanti da malattia arteriosa e trattamenti è importante nelle indagini patologie della malattia e futuro l'efficacia del trattamento. Qui, si descrive un metodo di replica fisiologica e patologica del flusso sanguigno destinato a determinare la risposta delle cellule vascolari in Pathol malattianologie. Il flusso di fluido provoca tensione tangenziale alla parete del vaso, che è un segnale meccanico importante nella salute recipiente, che colpisce tutte le celle all'interno del sistema vascolare. Diversi sensori meccanici sull'endotelio vascolare per taglio fluido sono stati identificati, tra cui ciglio primario dimostrato in studi recenti per endoteliale mechanosensing 8. L'attività delle cellule endoteliali e la morfologia sono interessati da velocità di flusso, la direzione e pulsatilità. Inoltre, cellule muscolari lisce (SMC) migrazione può essere influenzata da meccano-segnali di bassa velocità di flusso attraverso liquido interstiziale 9, e può essere anche attraverso la segnalazione paracrina da cellule endoteliali attraverso la loro risposta a scorrere e meccano-trasduzione di segnali di flusso tramite citochine rilasciare 10. La "dose" dipendenza di taglio medio, PI, e la segnalazione paracrina può anche essere interdipendenti. A tal fine, la determinazione della risposta cellulare vascolare al taglio fluido con vario "dosaggio" in coltura monostratoo co-coltura in vitro potrebbe fornire spunti meccanicistici in rimodellamento vascolare e migliorare la malattia e la previsione di trattamento. Il sistema di flusso utilizzato in questo esperimento consiste di una pompa di sangue, un flusso di smorzamento serbatoio dell'aria a monte, un misuratore di flusso a valle usato solo durante l'installazione sperimentale, una coltura cellulare a valle, a piatti paralleli camera di flusso, e mezzi serbatoio. Controllo di variabili di flusso vascolari quali portata media, battiti per minuto, e PI può essere realizzata mediante rate controllare il flusso, frequenza degli impulsi, e l'introduzione della pressione di smorzamento. Pompe per il sangue pulsatili sono disponibili con spostamento corsa variabile, a frequenza di corsa controllata, direttamente connesse a significare portata volumetrica, e frequenza degli impulsi. Introduzione di un serbatoio d'aria nel circuito di flusso consente di smorzamento pressione, riducendo il flusso di oscillazione grandezza. Media è un fluido incomprimibile, mentre l'aria all'interno della camera di attenuazione è comprimibile, permettendo sovrappressione dall'onda flusso di essereassorbita dalla compressione dell'aria. L'aria di rapporto di supporti consente il controllo su come si verifica molto smorzamento. Una coltura cellulare camera di flusso personalizzato di 75 mm di lunghezza e di 50 mm di larghezza è stato creato da acrilico. Flusso entra attraverso la porta di ingresso, e si espande attraverso il collettore di aspirazione, fornendo un flusso costante attraverso la totalità della camera di flusso. Flusso e strutture simili sono presenti in uscita della camera. Le cellule sono seminate su vetrini funzionalizzati, e successivamente attaccati alla camera di flusso. Questo permette di grandi popolazioni, facilmente recuperati dopo lo studio. Esperimenti di co-coltura possono utilizzare una membrana di policarbonato poroso per eliminare il contatto cellula-cellula tra culture consentendo trasporto citochina / flusso. Questo sistema è stato precedentemente utilizzato per modellare il flusso di alta PI e il suo effetto sulla cultura monostrato endoteliale e CE / SMC co-coltura 1, 10, per indagare la risposta cellulare al patologicamente alta malattia PI. Descrivendo il protocollo utilizzato per modellare questi con flussocondizioni, speriamo di aiutare gli altri nel determinare il contributo segnale di portata alla cella risposta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo di riprodurre flusso pulsatile in vitro, e può non primo passo per determinare il contributo delle condizioni di flusso a patologie malattia. Studi precedenti che utilizzano questo protocollo hanno trovato condizioni di flusso contribuiscono alla risposta infiammatoria vascolare. 1, 10 Inoltre, questo protocollo è destinato ai laboratori esperti. Come tale, né in profondità meccanica dei fluidi, né analisi biochimica viene qui descritto. Per la dinamica dei f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare le fonti di finanziamento, tra cui AHA (13GRNT16990019 a WT) e NHLBI (HL097246 e HL119371 di WT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
