In Vitro Modell av fysiologiske og patologiske Blood Flow med Application å Undersøkelser av Vaskulær Cell Remodeling

Summary

Denne protokollen replikerer fysiologiske eller patologiske blodstrøm in vitro for å hjelpe til med å bestemme cellerespons i sykdoms patologier. Ved å introdusere et trykkdempekammer nedstrøms for en blodpumpe, kan blodstrømmen på tvers av blodkar bli rekapitulert og pålagt et monolag av vaskulært endotel eller en mimetisk ko-kulturen.

Abstract

Vaskulær sykdom er en vanlig dødsårsak i USA. Heri presenterer vi en metode for å undersøke bidraget av strømningsdynamikk mot vaskulær sykdom patologi. Usunne arteriene ofte har vegg avstivning, arrdannelse eller delvis stenose som kan alle påvirke væskemengder, og omfanget av pulserende strømning, eller pulsatility indeksen. Replikasjon av forskjellige strømningsforhold er resultatet av innstiller en strømningstrykket dempekammeret nedstrøms for en blodpumpe. Innføring av luft i et lukket system gjør det mulig for strømnings et komprimerbart medium for å absorbere pulserende trykk fra pumpen, og derfor varierer den pulsatility indeksen. Metoden som er beskrevet heri er bare gjengitt, med meget kontrollerbar inngang, og lett målbare resultater. Noen av begrensningene er gjenskaping av komplekset fysiologiske pulsbølgeform, som bare er tilnærmet ved hjelp av systemet. Endotelceller, glatte muskelceller, og fibroblaster påvirkes av blodstrømmen through arterien. Den dynamiske komponent av blodstrøm bestemmes av hjertets minuttvolum og arterievegg compliance. Vascular cell mekanisk-transduksjon av strømningsdynamikk kan utløse cytokinfrigjøring og krysstale mellom celletyper i arterien. Ko-kultur av vaskulære celler er et mer nøyaktig bilde reflekterende celle-celle-interaksjon i blodkarveggen, og vaskulær respons på mekanisk signalering. Bidrag av strømningsdynamikken, inkludert celleresponsen til de dynamiske og midlere (eller jevn) komponenter av strømningen, er derfor et viktig metrisk å bestemme sykdomspatologien og behandlingseffekt. Ved å innføre en de vitro-ko-kulturmodell og trykk demping nedstrøms av blodpumpe som frembringer simulerte blodsirkulasjon, kan forskjellige arteriell sykdom patologier undersøkes.

Introduction

Sykelighet for hjerte- og karsykdommer er den største i Amerika, med mange som følge av usunn blodkar. Sunn arterier bestå av elastisk vev, med myk luminal overflaten belagt med en endotelceller (EF) enkeltlag. Arteriell strøm kan modelleres som en oscillerende bølgefunksjon med positiv middelstrømningshastighet. Den pulsatility indeks (PI) er kvotienten for pendling magnitude og mener flow (PI = (Max -.. Min) / Mean), ¹ og har blitt modellert in vitro med variabel fartøy elastisitet ^à arteriell elastisitet er viktig for lagring av flyt. energi fra hjerte sammentrekninger, strekke henhold systoliske trykket, og spiller en viktig rolle i modulerblodstrømmen PI. Fordi hjertet opprettholder en jevn, pulsatile, volumetrisk strømning, øker arteriell utvidelse tverrsnittsarealet, øke strømningsstabilitet ved å redusere strømningshastighet, skjærspenning, og PI. Ofte, usunn arterier presentere endringer i elastisiteteller etterlevelse, viser stivne fra vaskulær remodellering, arrvev eller forkalkninger ^{tre, fire.} I tillegg kan andre vaskulære forstyrrelser, slik som neointimal hyperplasi (NIH), aneurisme ⁵ og ⁶ hypertensjon og vaskulær fibrose ^4, innsnevre fartøy diameter. Men dagens behandling og enhets behandling av vaskulære sykdommer ofte overse betydningen av åreveggen etterlevelse eller blodstrøm dynamikk i vaskulær sykdom som ofte komplisert av endringer i fartøy morfologi og egenskaper. Verken ballong angioplastikk eller stenting besvare komplikasjon av veggen elastisitet ^7. Derfor strømmer in vitro modellering av blod som følge av arteriell sykdom og behandling er viktig i å undersøke sykdoms patologi og fremtidig effekt av behandlingen. Heri beskrives en fremgangsmåte for å replikere fysiologiske og patologiske blodstrøm utformet for å bestemme cellerespons i vaskulær sykdom Pathologies. Fluidstrøm forårsaker skjærspenning ved beholderveggen, noe som er et viktig mekanisk signal i kar helse, påvirker alle celler i vaskulaturen. Flere mekaniske sensorer på blodåreendotelets for væske skjær har blitt identifisert, inkludert primær cilium vist i nyere studier for endothelial mechanosensing ^8. Endotelceller aktivitet og morfologi påvirkes av strømningshastighet, retning og pulsatility. I tillegg kan glatt muskelcelle (SMC) migrering bli påvirket av mekanisk-signaler med lav strømningshastighet gjennom interstitiell væske ^9, og kan også være gjennom parakrin signalering fra endotelceller gjennom deres respons på strømning og mekanisk-transduksjon av strømningssignaler via cytokin ^frigjøre 10. Den "dose" avhengighet av midlere skjær, PI, og parakrine signale kan også være avhengige av hverandre. For å oppnå dette, bestemmelse av vaskulære celle-respons til fluidskjær med variert «dosering» i monolagskultureller co-kultur in vitro kunne gi mekanistiske innsikt i vaskulær remodellering og forbedre sykdom og behandling prediksjon. Strømningssystemet som brukes i dette eksperimentet består av en blodpumpe, en oppstrøms strømnings demping luftbeholder, en nedstrøms strømningsmåler kun brukes under eksperimentelle oppsettet, en nedstrøms cellekultur, parallell-plate strømningskammeret, og media reservoaret. Kontroll av vaskulære strømnings variabler som betyr strømningshastighet, slag per minutt, og PI kan oppnås ved å kontrollere strømningshastighet, pulsfrekvens, og innføring av trykk demping. Pulserende blodpumper er utstyrt med variabel slaglengde fortrengning, ved kontrollert slag frekvens, knyttet direkte til bety volumetrisk strømningshastighet, og pulsfrekvensen. Innføring av et luftreservoar inne i strømningskretsen gir mulighet for trykk demping, noe som reduserer strømnings oscillasjon størrelsesorden. Media er en inkompressibel væske, mens luft inne i dempekammeret er sammentrykkbart, slik at overtrykket fra strømnings bølgen å væreabsorbert av komprimert luft. Luften i media forhold tillater kontroll over hvor mye demping oppstår. En tilpasset cellekultur strømningskamret 75 mm i lengde med 50 mm i bredden ble opprettet fra akryl. Strømning kommer inn gjennom innløpsåpningen, og ekspanderer gjennom innløpsmanifolden, og gir konsistent strømning over helheten av strømningskammeret. Lignende flyt og strukturer er til stede ved kammerutløpet. Cellene blir sådd ut på funksjonaliserte objektglass, og deretter festet til strømningskammeret. Dette åpner for store bestander, lett hentes etter at studien. Co-kultur eksperimenter kan bruke en porøs polykarbonatmembran for å fjerne celle-til-celle-kontakt mellom kulturer samtidig som den tillater cytokin / fasetransport. Dette systemet har tidligere vært brukt til å modellere høy PI strømning og dens virkning på endoteliale monolagskultur og EC / SMC ko-kultur ^{1, 10,} for å undersøke celleresponsen på patologisk høy PI sykdom. Ved å beskrive den protokollen som brukes til å modellere disse flyt conforhold, håper vi å hjelpe andre med å bestemme flyten signal bidrag til celle respons.

Protocol

1. silanisering og biomolekyl funksjon av Slide eller polykarbonat Membran Merk: Mange av kjemikaliene og løsninger innenfor denne protokollen har høye fordampingshastigheter (etanol (EtOH), aceton, osv). Andre tiltak medfører lange inkuberingstider for lave fordampning priser. Parafin film anbefales for å forsegle beholderne. Forsiktig: Mange av de kjemikalier (inkludert: svovelsyre, aceton, (3-aminopropyl) trietoksysilan, glutaraldehyd, EtOH) betraktes som farlig, eller flyktig….

Representative Results

Opprettholdelse av strømningsforhold er avhengig av korrekt montering av strømningskretsen (figur 1). Tubing diameter er et viktig valg i sammenstillingen, med større diameter redusere strømningsmotstand og påfølgende trykkfall før og etter kulturen kammeret. For å sikre ment trykk og strømningshastighet, montere systemet med flow meter før forsøket med tiltenkt tubing. Justering av kultur kammer vakuum kanal (figur 2), med perforeringer på silisium pakningen (ikke avbildet)…

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for å gjengi pulserende strømning in vitro, og kan være medvirkende første trinnet i å bestemme bidraget av strømningsforholdene til sykdoms patologier. Tidligere studier som bruker denne protokollen har funnet strømningsforhold bidra til vaskulær betennelsesreaksjon. ^{1, 10} tillegg denne protokollen er ment for erfarne laboratorier. Som sådan, hverken i dybdefluidmekanikk, eller biokjemiske analyser er beskrevet heri. For mer avanserte væskedynamikk, <s…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropyl)trethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Glass Slide (70mm x 50mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polycarbonate Membrane	Millipore Corp.	HTTP09030
Silicone Gasket	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectin (25 μg/mL)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Damping Chamber			This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.
Blood Pump	Harvard Apparatus	529552
Poly-Vinyl Carbonate Tubing	US Plastic	65066, 65063, 65062	Various sizes may be required
Luer Connections	Nordson Medical	Various	Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.
Culture Chamber	Machined in-house	Custom	Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber
Square Petri Dish	Cole-Parmer	EW-14007-10
Glass Slide Holder	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Bovine Serum	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Flow Meter	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Steel Cannula	General Laboratory Supply	S8365-1