In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Summary

Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

Abstract

A doença vascular é uma causa comum de morte nos Estados Unidos. Aqui, apresentamos um método para examinar a contribuição da dinâmica de fluxo em direção patologias doença vascular. Artérias saudáveis ​​apresentam frequentemente enrijecimento da parede, cicatrizes, ou estenose parcial que pode afetar as taxas de fluxo de fluido, e a magnitude do fluxo pulsátil, ou índice de pulsatilidade. Replicação de várias condições de fluxo é o resultado de uma pressão de ajuste de fluxo a jusante da câmara de uma bomba de sangue de amortecimento. A introdução de ar dentro de um sistema fechado permite que o fluxo de um meio compressível para amortecer a pressão pulsátil da bomba, e, por conseguinte, variar o índice de pulsatilidade. O método descrito aqui é simplesmente reproduzidas, com entrada altamente controlável, e os resultados facilmente mensuráveis. Algumas limitações são recriação da forma de onda de pulso fisiológico complexo, o que só é aproximado pelo sistema. As células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos e são afectados pelo fluxo de sangue thrOugh da artéria. A componente dinâmica de fluxo de sangue é determinada através da saída da parede arterial e complacência cardíaca. Vascular célula mecano-transdução de dinâmica de fluxo pode desencadear a liberação de citocinas e cross-talk entre tipos celulares dentro da artéria. Co-cultura de células vasculares é uma interacção mais preciso célula-célula imagem de reflexão sobre a parede do vaso sanguíneo e a resposta vascular à sinalização mecânica. Contribuição de dinâmica de fluxo, incluindo a resposta celular aos componentes dinâmicos e médios (ou equilíbrio) de fluxo, é, por conseguinte, uma métrica importante na determinação da patologia da doença e da eficácia do tratamento. Através da introdução de um modelo de co-cultura in vitro e pressão de amortecimento a jusante da bomba de sangue que produz o débito cardíaco simulado, diversas patologias de doença arterial podem ser investigadas.

Introduction

Taxas de morbidade para doenças cardiovasculares são a maior da América, com muitos resultante da vasculatura insalubre. As artérias saudáveis ​​consistem em tecido elástico, com a superfície luminal macia revestida com uma monocamada de células endoteliais (CE). Fluxo arterial pode ser modelado como uma função de onda oscilante com taxa média de fluxo positivo. O índice de pulsatilidade (PI) é o quociente de oscilação magnitude ea média de fluxo (PI = (Max. – Min.) / Média), ¹ e foi modelado in vitro com a elasticidade dos vasos variável ² Arterial elasticidade é importante no armazenamento do fluxo. energia a partir de contracções do coração, dilatando sob pressão sistólica, e desempenha um papel importante na modulação PI do fluxo sanguíneo. Porque o coração mantém um consistente, pulsátil, fluxo volumétrico, a expansão arterial aumenta a área de corte transversal, o reforço da estabilidade do fluxo, reduzindo a velocidade do fluxo, tensão de cisalhamento e PI. Freqüentemente, as artérias saudáveis ​​apresentam alterações a elasticidadeou de conformidade, exibindo enrijecimento de remodelação vascular, tecido cicatricial ou calcificação ^{3, 4.} Além disso, outros distúrbios vasculares, tais como a hiperplasia neointimal (NIH), aneurisma ⁵ e ⁶ e hipertensão vascular fibrose ^4, pode contrair o diâmetro dos vasos. No entanto, o tratamento medicamentoso atual e tratamento de doenças vasculares dispositivo muitas vezes negligenciar a importância da dinâmica de conformidade da parede do vaso ou do fluxo sanguíneo na doença vascular que é muitas vezes complicada por alterações na morfologia navio e propriedades. Nem a angioplastia com balão, nem implante de stent responder a complicação da parede elasticidade ^7. Portanto, in vitro modelagem de fluxos de sangue resultante de doença arterial e tratamentos é importante na investigação de doenças e patologias futuro eficácia do tratamento. Aqui, nós descrevemos um método de replicar o fluxo sanguíneo fisiológico e patológico concebido para determinar a resposta de células na doença vascular Patholgias. O fluxo do fluido faz com que a tensão de cisalhamento na parede do vaso, que é um sinal mecânico importante na saúde dos vasos, que afecta todas as células no interior da vasculatura. Vários sensores mecânicos sobre o endotélio vascular de cisalhamento de fluidos, foram identificados, incluindo cílio primário mostrado em estudos recentes para endotelial mechanosensing ^8. A atividade das células endoteliais e morfologia são afetadas pela velocidade de fluxo, direção e pulsatilidade. Além disso, células do músculo liso (SMC) migração pode ser afectada por Mecano-sinais de baixa velocidade de fluxo através do fluido intersticial ^9, e pode também ser através da sinalização parácrina a partir de células endoteliais através da sua resposta ao fluxo e mecano-transdução de sinais de fluxo através de citocina liberar ^10. A "dose" dependência de cisalhamento média, PI, e sinalização parácrina também podem ser interdependentes. Para este fim, a determinação da resposta vascular à célula de cisalhamento de fluidos com "dosagem" variada em cultura em monocamadaou co-cultura in vitro poderiam fornecer insights mecanicistas em remodelação vascular e melhorar a doença e previsão de tratamento. O sistema de fluxo utilizado neste experimento consiste em uma bomba de sangue, um fluxo de amortecimento reservatório de ar a montante, um medidor de vazão a jusante apenas utilizado durante a configuração experimental, uma cultura de células a jusante, de placas paralelas câmara de fluxo, e media reservatório. Controle de variáveis ​​de fluxo vascular, tais como vazão média, batidas por minuto, e PI pode ser alcançada através do controlo do caudal, frequência de pulso, e introdução de pressão de amortecimento. Bombas de sangue pulsátil estão disponíveis com deslocamento variável acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral na freqüência controlada, directamente relacionadas com a taxa média de fluxo volumétrico, e frequência de pulso. Introdução de um reservatório de ar no interior do circuito de escoamento permite amortecimento de pressão, reduzindo a oscilação do fluxo de magnitude. Media é um fluido incompressível, enquanto o ar dentro da câmara de amortecimento é compressível, permitindo que o excesso de pressão a partir da onda de fluxo para serabsorvida pela compressão de ar. O ar à relação da mídia permite o controle sobre a forma como ocorre muito amortecimento. Um costume cultura de célula de fluxo câmara de 75 mm de comprimento por 50 mm de largura foi criado a partir de acrílico. Fluxo entra através da porta de entrada, e expande-se através do colector de entrada, fornecendo um fluxo consistente entre os elementos da câmara de escoamento. Fluxo e estruturas semelhantes estão presentes na saída da câmara. As células são semeadas em lâminas de funcionalizados, e subsequentemente ligados à câmara de fluxo. Isto permite uma grande população, facilmente recuperados após o estudo. Experiências de co-cultura pode utilizar uma membrana porosa de policarbonato para eliminar o contacto célula-a-célula entre as culturas, permitindo o transporte de citocina / fluxo. Este sistema foi anteriormente usado para modelar um elevado caudal de PI e o seu efeito sobre a cultura monocamada endotelial e CE / SMC co-cultura ^{1, 10,} para investigar a resposta celular à doença patologicamente elevada PI. Ao descrever o protocolo usado para modelar estes fluxo concondições, esperamos ajudar os outros para cálculo da contribuição de sinal para a célula de fluxo de resposta.

Protocol

1. Silanização e biomolécula funcionalização de slide ou Policarbonato Membrana Nota: Muitos dos produtos químicos e soluções no âmbito deste protocolo têm altas taxas de evaporação (etanol (EtOH), acetona, etc.). Outros passos implicam tempos de incubação longos para taxas de evaporação baixas. Parafina filme é recomendado para selar recipientes. Cuidado: Muitos dos produtos químicos (tais como: ácido sulfúrico, acetona, (3-aminopropil) trietoxissilano, glutaralde…

Representative Results

Manutenção de condições de fluxo é dependente de uma montagem correcta do circuito de fluxo (Figura 1). Tubulação de diâmetro é uma selecção importante na montagem, com diâmetros maiores diminuem a resistência do fluxo de queda de pressão e subsequente antes e depois da câmara de cultura. Para garantir a velocidade de pressão e fluxo pretendido, montar o sistema com medidor de fluxo antes de experimento com tubulação pretendido. Alinhamento de canal de vácuo câmara de cultura <strong…

Discussion

Este protocolo descreve um método de reprodução de fluxo pulsátil in vitro, e pode ser o primeiro passo fundamental para determinar a contribuição de condições de fluxo para patologias de doenças. Estudos anteriores, usando este protocolo ter encontrado condições de fluxo de contribuir para a resposta inflamatória vascular. ^{1, 10} Além disso, este protocolo destina-se a laboratórios experientes. Como tal, nem em profundidade mecânica dos fluidos, nem análise bioquímica é aqui descrit…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropyl)trethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Glass Slide (70mm x 50mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polycarbonate Membrane	Millipore Corp.	HTTP09030
Silicone Gasket	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectin (25 μg/mL)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Damping Chamber			This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.
Blood Pump	Harvard Apparatus	529552
Poly-Vinyl Carbonate Tubing	US Plastic	65066, 65063, 65062	Various sizes may be required
Luer Connections	Nordson Medical	Various	Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.
Culture Chamber	Machined in-house	Custom	Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber
Square Petri Dish	Cole-Parmer	EW-14007-10
Glass Slide Holder	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Bovine Serum	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Flow Meter	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Steel Cannula	General Laboratory Supply	S8365-1