I vitro-modell av fysiologiska och patologiska blodflöde med Application till Undersökningar av Vascular Cell ombyggnad
Summary
Detta protokoll replikerar fysiologiska eller patologiska blodflödet in vitro för att underlätta bestämning av cellsvar i sjukdoms patologier. Genom att införa en tryckdämpningskammare nedströms om en blodpump, kan blodflöde tvärs vaskulaturen dets förlopp och införas på ett monoskikt av kärlendotel eller en mimetisk samodling.
Abstract
Vascular sjukdom är en vanlig dödsorsak i USA. Häri presenterar vi en metod för att undersöka bidraget från flödesdynamik mot vaskulära sjukdomar sjukdom. Ohälsosamma artärer ofta förekommer med väggstelhet, ärrbildning eller delvis stenos som alla kan påverka vätskeflödeshastigheter, och storleken på pulserande flöde, eller pulsatilitet index. Replikation av olika strömningsförhållanden är resultatet av avstämning av en flödestryckdämpningskammare nedströms om en blodpump. Införande av luft i ett slutet flöde möjliggör en komprimer medium för att absorbera pulserande trycket från pumpen, och därför varierar pulsatiliteten index. Metoden som beskrivs häri enkelt reproduceras, med mycket kontrollerbar ingång, och lätt mätbara resultat. Vissa begränsningar är återskapande av den komplexa fysiologiska pulsvågform, som endast approximeras av systemet. Endotelceller, glatta muskelceller, och fibroblaster påverkas av blodflödet thrgrundlig artären. Den dynamiska komponenten av blodflöde bestäms av hjärtminutvolym och artärväggen efterlevnad. Vaskulär cellmekanisk transduktion av flödesdynamik kan utlösa cytokinfrisättning och överhörning mellan celltyper inuti artären. Co-kultur av vaskulära celler är en mer rättvisande bild reflekterande cell-cellinteraktion på blodkärlsväggen och kärl svar på mekanisk signalering. Bidrag från flödesdynamik, inklusive cell svar på de dynamiska och medel (eller stadig) komponenter i flödet, är därför ett viktigt mått för att bestämma sjukdomspatologi och behandling effektivitet. Genom att införa ett in vitro co-kultur-modellen och tryckdämpning nedströms blodpump som producerar simulerad hjärtminutvolym, kan olika arteriella patologier sjukdoms undersökas.
Introduction
Sjuklighet för hjärt- och kärlsjukdomar är den största i Amerika, med många till följd av ohälsosamma kärl. Friska artärer består av elastisk vävnad, med mjuk luminala ytan belagd med en endotelcell (EC) monoskikt. Arteriell flöde kan modelleras som en oscillerande våg funktion med positiv genomsnittlig flödeshastighet. Pulsatiliteten Index (PI) är kvoten av svängnings magnitud och genomsnittlig flödes (PI = (Max -.. Min) / medelvärde), 1 och har modellerats in vitro med variabel kärl elasticitet 2 Arteriell elasticitet är viktig vid lagring av flödet. energi från hjärta sammandragningar, utvidga enligt systoliskt tryck, och spelar en viktig roll i att modulera blodflödet PI. Eftersom hjärtat upprätthåller en konsekvent, pulserande, volumetriska flödet ökar arteriell expansionstvärsnittsarea, öka stabiliteten flödet genom att minska flödeshastigheten, skjuvspänning, och PI. Ofta ohälsosamma artärer presentera förändringar elasticiteteller efterlevnad, visar styv från kärlremodellering, ärrvävnad eller förkalkning 3, 4. Dessutom kan andra vaskulära sjukdomar, såsom neointimal hyperplasi (NIH), 5 aneurysm och hypertoni 6 och vaskulär fibros 4, tygla fartyg diameter. Men nuvarande läkemedelsbehandling och enhets behandling av kärlsjukdomar ofta försummar betydelsen av kärlväggen efterlevnad eller blod flödesdynamik i vaskulär sjukdom som ofta kompliceras av förändringar i fartyg morfologi och egenskaper. Varken ballongvidgning eller stent besvara komplikation av vägg elasticitet 7. Därför in vitro modellering av blod flöden till följd av arteriell sjukdom och behandling är viktigt att utreda sjukdoms sjukdomar och framtida effekt av behandlingen. Häri beskriver vi en metod att replikera fysiologisk och patologisk blodflöde utformad för att bestämma cellsvar i vaskulär sjukdom Pathologies. Vätskeflöde orsakar skjuvspänning på kärlväggen, vilket är en viktig mekanisk signal i kärlet hälsa, som påverkar alla celler i kärlsystemet. Flera mekaniska sensorer på kärlendotelet för fluidfriktions har identifierats, inklusive primär cilium visas i nya studier för endotel mechanosensing 8. Endotelial cellaktivitet och morfologi påverkas av flödeshastighet, riktning och pulsatilitet. Dessutom kan glatta muskelceller (SMC) migrering påverkas av mekaniska-signaler av låg hastighet flöde genom interstitiell vätska 9, och kan också vara genom den parakrina signalering från endotelceller genom deras respons att flyta och mekano-transduktion av flödessignaler via cytokin släppa 10. Den "dos" beroende av medel skjuvning, PI och parakrin signalering kan också vara beroende av varandra. För detta ändamål bestämning av vaskulär cellsvar på fluidfriktions med varierad "dosering" i monoskiktkultureller co-kultur in vitro kan ge mekanistiska insikter i kärlremodellering och förbättra sjukdom och behandling förutsägelse. Flödes system som används i detta experiment består av en blodpump, en uppströms flödesdämpningsluftreservoar, en nedströms flödesmätare endast används under experimentuppställning, en nedströms cellodling, parallella plattor flödeskammare, och mediebehållaren. Kontroll av vaskulära flödesvariabler såsom detta flödeshastighet, takter per minut, och PI kan åstadkommas genom att styra flödeshastigheten, pulsfrekvens, och införande av tryckdämpning. Pulserande blodpumpar finns med variabel slagvolym, vid kontrollerad slagfrekvens, som direkt betyda volymflödeshastighet och pulsfrekvens. Införande av en luftbehållare i flödeskretsen möjliggör tryck dämpning, minskar svängning flödes storlek. Media är en inkompressibel vätska, medan luft inuti dämpningskammaren är kompressibel, så att övertrycket från flödesvågen att varaabsorberas av luftkomprimering. Luften förhållande mellan medie möjliggör kontroll över hur mycket dämpning uppträder. En anpassad cellodlingsflödeskammare 75 mm i längd och 50 mm i bredd skapades från akryl. Flödes inträder genom inloppsöppningen, och expanderar genom insugningsröret, vilket ger konsekvent flöde över helheten av flödeskammaren. Liknande flöde och strukturer är närvarande vid kammarens utlopp. Celler sås på funktionaliserade bilder, och därefter knuten till flödeskammaren. Detta möjliggör för stora populationer, lätt hämtas efter studien. Co-kultur experiment kan använda ett poröst polykarbonatmembran för att eliminera cell till cell kontakt mellan kulturer samtidigt som transport cytokin / flöde. Detta system har tidigare använts för att modellera hög PI flöde och dess effekt på endothelial monolager kultur och EG / SMC co-kultur 1, 10, för att undersöka cellsvar mot patologiskt hög PI sjukdom. Genom att beskriva det protokoll som används för att modellera dessa flödes conförhållanden, hoppas vi kunna hjälpa andra i att bestämma flödessignal bidrag till cellsvar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att reproducera pulserande flöde in vitro och kan vara ett medel första steg vid bestämning bidrag flödesförhållanden till sjukdoms patologier. Tidigare studier med detta protokoll har hittat flödesförhållanden bidrar till vaskulär inflammatorisk respons. 1, 10 Dessutom, detta protokoll är avsedd för erfarna laboratorier. Som sådan, varken djupgående strömningsmekanik, eller biokemisk analys beskrivs här. För mer avancerade fluiddynamik, 1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna finansieringskällor, inklusive AHA (13GRNT16990019 till WT) och NHLBI (HL097246 och HL119371 till WT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
