Modèle in vitro de physiologiques et pathologiques Blood Flow avec application aux enquêtes de cellules vasculaires Rénovation
Summary
Ce protocole se réplique du flux sanguin physiologique ou pathologique in vitro pour aider à déterminer la réponse des cellules dans des pathologies de la maladie. En introduisant une pression en aval de la chambre une pompe à sang amortissement, le flux sanguin à travers le système vasculaire peut être récapitulé et prélevée sur une monocouche de l'endothélium vasculaire ou une co-culture mimétique.
Abstract
Maladie vasculaire est une cause fréquente de décès aux États-Unis. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la contribution de la dynamique des flux vers les pathologies de maladies vasculaires. Artères malsaines présentent souvent raidissement de paroi, des cicatrices, ou une sténose partielle qui peuvent tous affecter les taux d'écoulement des fluides, et l'ampleur des flux pulsatile, ou de l'indice de pulsatilité. Replication de différentes conditions d'écoulement est le résultat d'un réglage de la pression d'écoulement en aval de la chambre une pompe à sang amortissement. L'introduction d'air dans un système fermé de circulation permet à un milieu compressible pour absorber la pression pulsatoire de la pompe, et donc varier l'indice de pulsatilité. Le procédé décrit ici est tout simplement reproduit, avec entrée hautement contrôlable, et les résultats facilement mesurables. Certaines limitations sont reconstitution de la forme d'onde d'impulsion physiologique complexe, qui est seulement une approximation par le système. Les cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les fibroblastes, sont affectées par le thr d'écoulement de sangOugh l'artère. La composante dynamique de la circulation sanguine est déterminée par l'observation de sortie et la paroi artérielle cardiaque. Cellules vasculaires mécano-transduction de la dynamique d'écoulement peut déclencher la libération de cytokines et de diaphonie entre les types de cellules dans l'artère. Co-culture de cellules vasculaires est une image qui reflète plus précise interaction cellule-cellule sur la paroi du vaisseau sanguin et de la réponse vasculaire de signalisation mécanique. Contribution de la dynamique des flux, y compris la réponse des cellules aux composants dynamiques et moyennes (ou stables) de flux, est donc une mesure importante dans la détermination de la pathologie de la maladie et l'efficacité du traitement. Grâce à l'introduction d'un modèle in vitro de co-culture et de la pression d'amortissement en aval de la pompe de sang qui produit le débit cardiaque simulé, diverses pathologies de maladies artérielles peuvent être étudiées.
Introduction
Les taux de morbidité pour les maladies cardiovasculaires sont la plus grande en Amérique, avec de nombreux résultant de vascularisation malsain. Des artères saines sont constituées de tissu élastique, avec une surface luminale doux revêtu d'une cellule endothéliale (CE) monocouche. Débit artériel peut être modélisée comme une fonction d'onde d'oscillation avec un débit moyen positif. L'indice de pulsatilité (PI) est le quotient d'oscillation ampleur et débit moyen (PI = (Max -. Min.) / Moyenne), 1 et a été modélisée in vitro avec élasticité variable de la cuve 2 élasticité artérielle est important dans le stockage de l'écoulement. énergie des contractions cardiaques, dilatant sous pression systolique, et joue un rôle important dans la modulation de PI d'écoulement de sang. Parce que le coeur maintient une approche cohérente, pulsatile, débit volumétrique, expansion artérielle augmente la zone de coupe, l'amélioration de la stabilité de l'écoulement en réduisant la vitesse d'écoulement, contrainte de cisaillement, et PI. Fréquemment, les changements artères malsaines présentes à l'élasticitéou de conformité, l'affichage de raidissement remodelage vasculaire, le tissu cicatriciel ou calcification 3, 4. En outre, d'autres troubles vasculaires, tels que hyperplasie néo-intimale (NIH), 5 l'hypertension et l'anévrisme et 6 fibrose vasculaire 4, peuvent se contracter le diamètre du vaisseau. Cependant, le traitement médicamenteux en cours et le traitement de l'appareil de maladies vasculaires négligent souvent l'importance du respect de la paroi de la cuve ou le débit sanguin dans la dynamique maladie vasculaire qui est souvent compliquée par des changements dans la morphologie de la cuve et des propriétés. Ni l'angioplastie par ballonnet ni stenting repondre la complication de la paroi 7 élasticité. Par conséquent, la modélisation in vitro de sang flux résultant de la maladie artérielle et des traitements est important dans les enquêtes sur les pathologies de la maladie et l'efficacité future du traitement. Ici, nous décrivons un procédé de réplication du flux sanguin physiologiques et pathologiques conçu pour déterminer la réponse cellulaire dans la maladie vasculaire Pathollogies. L'écoulement du fluide provoque la contrainte de cisaillement à la paroi de la cuve, qui est un signal mécanique important dans la santé des vaisseaux, affectant toutes les cellules dans le système vasculaire. Plusieurs capteurs mécaniques sur l'endothélium vasculaire pour le cisaillement de fluide ont été identifiés, y compris cil primaire démontré dans des études récentes pour endothéliale mechanosensing 8. L'activité des cellules endothéliales et la morphologie sont affectés par la vitesse d'écoulement, la direction et pulsatilité. En outre, des cellules musculaires lisses (SMC) la migration peut être affectée par mécano-signaux de circulation à faible vitesse par liquide interstitiel 9, et peut également se faire par la signalisation paracrine à partir de cellules endothéliales par leur réponse à l'écoulement et mécano-transduction des signaux de débit via cytokine libérer 10. La "dose" dépendance de cisaillement moyen, PI, et la signalisation paracrine peut également être interdépendants. A cet effet, la détermination de la réponse cellulaire à un cisaillement fluide vasculaire avec "dosage" varié en culture monocoucheou co-culture in vitro pourrait fournir des indications mécanistes dans le remodelage vasculaire et d'améliorer la maladie et la prédiction de traitement. Le système d'écoulement utilisé dans cette expérience se compose d'une pompe à sang, un réservoir d'air de l'écoulement d'amortissement en amont, un débitmètre en aval seulement utilisée lors de la configuration expérimentale, une culture de cellules en aval, la chambre d'écoulement à plaques parallèles, et le réservoir de support. Contrôle des variables de flux vasculaires tels que débit moyen, battements par minute, et PI peut être atteint par le taux de contrôle de flux, la fréquence du pouls et de la pression d'amortissement mise en place. Pompes à sang pulsatiles sont disponibles avec course variable déplacement, à la fréquence de course contrôlée, directement liées à signifier débit volumétrique, et la fréquence d'impulsion. Introduction d'un réservoir d'air à l'intérieur du circuit d'écoulement permet un amortissement de la pression, la réduction de l'oscillation d'écoulement de grandeur. Media est un fluide incompressible, tandis que l'air à l'intérieur de la chambre d'amortissement est compressible, permettant excès de pression de la vague de flux pour êtreabsorbée par compression de l'air. Le rapport air des médias permet un contrôle sur la quantité de l'amortissement se produit. Une chambre d'écoulement de culture de cellules sur mesure 75 mm de longueur par 50 mm de largeur a été créé à partir d'acrylique. Écoulement entre par l'orifice d'entrée, et se dilate à travers le collecteur d'admission, assurer un écoulement uniforme dans la totalité de la chambre d'écoulement. Flux et des structures similaires sont présents à la sortie de la chambre. Les cellules sont ensemencées sur des lames fonctionnalisées, et ensuite fixés à la chambre d'écoulement. Cela permet à de grandes populations, facilement récupérés après l'étude. Des expériences de co-culture peuvent utiliser une membrane de polycarbonate poreux pour éliminer le contact de cellule à cellule entre les cultures tout en permettant le transport cytokine / débit. Ce système a déjà été utilisé pour modéliser l'écoulement de haute PI et son effet sur la culture monocouche endothéliale et CE / SMC co-culture 1, 10, pour étudier la réponse cellulaire à la maladie de PI pathologiquement élevé. En décrivant le protocole utilisé pour modéliser ces flux conconditions, nous espérons aider les autres dans la détermination de la contribution de signal de débit à la cellule de réponse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un procédé de reproduction d'écoulement pulsatile in vitro, et peut-être première étape dans la détermination instrumentale de la contribution des conditions d'écoulement à des pathologies de la maladie. Des études antérieures utilisant ce protocole ont trouvé des conditions de flux contribuent à la réponse inflammatoire vasculaire. 1, 10 En outre, ce protocole est destiné aux laboratoires expérimentés. En tant que tel, ni en profondeur la mécanique des …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement, y compris les AHA (13GRNT16990019 à WT) et NHLBI (HL097246 et HL119371 à WT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
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