דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Summary

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Abstract

לאחרונה, iPSCs משך תשומת לב כמקור חדש של תאים עבור טיפולי משובי. למרות שהשיטה הראשונית לiPSCs יצירה הסתמכה על fibroblasts עורי מתקבל על ידי ביופסיה פולשנית והחדרה הגנומי retroviral של transgenes, היו מאמצים רבים כדי להימנע מחסרונות אלה. תאי T היקפיים אנושיים הם מקור תא ייחודי ליצירת iPSCs. iPSCs שמקורם בתאי T לכלול ארגון מחדש של הקולטן תא T (TCR) גנים והם מקור של תאי T אנטיגן ספציפי. בנוסף, סידור מחדש קולט תא T בגנום יש הפוטנציאל לתייג שורות תאים בודדות ולהבחין בין תאים מושתלים ותורם. ליישום קליני בטוח של iPSCs, חשוב כדי למזער את הסיכון של חשיפת iPSCs חדש שנוצר לגורמים מזיקים. למרות שתאים בסרום ומזין שור עובריים היו חיוניים לתרבות תאי גזע pluripotent, עדיף להסיר אותם ממערכת התרבות כדי להפחית את הסיכוןשל פתוגניות בלתי צפויה. כדי לטפל בזה, הקמנו פרוטוקול להפקת iPSCs מתאי T היקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי כדי להפחית את הסיכון של חשיפת iPSCs לפתוגנים לא מוגדרים. למרות שהטיפול בוירוס סנדאי דורש ציוד עם רמת הבטיחות הביולוגית המתאימה, נגיף מדביק סנדאי מופעל תאי T ללא החדרת הגנום, עדיין עם יעילות גבוהה. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את הדור של iPSCs מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים ללא מזין באמצעות שילוב של תרבית תאי T מופעלת ווירוס סנדאי.

Introduction

iPSCs משך תשומת לב רבה כמקור פורץ של תאים לרפואת רגנרטיבית ^1-3. נכון להיום, שיטות מגוונות ליצירת iPSCs דווחו ^4,5. בין אלה, iPSCs שנוצר מתאי T האנושיים היה עניין מיוחד בשל השיטה פחות פולשנית של תא דגימה ^6-8. בנוסף, iPSCs שמקורם בתאי T לכלול ארגון מחדש של גן קולט תא T (TCR) ולכן הם מקור לתאי T אנטיגן ספציפי ^9,10. לכן, יצירת iPSCs תא נגזר T שימושי להתקדמות רפואת רגנרטיבית בבטחה.

שיטה זו מבוססת על הרעיון של הפחתת הסיכון לפתוגניות בלתי צפויה. ליישום קליני בטוח של iPSCs חשוב כדי להפחית את הסיכון של חשיפה לפתוגנים ^11. בעבר במערכות תרבות רבות של תאי גזע pluripotent, תאי סרום ומזין שור עובריים שימשו כמגיב חיוניזה ^12. עם זאת, ההסרה של שני חומרים כימיים אלה ממערכת התרבות עדיפה לדור iPSC כדי להפחית את הסיכון של פתוגניות בלתי צפויה.

בנוסף, בשיטה זו יש את היתרון של הימנעות דגימת תאים פולשניים מחולים והכנה מייגע של תאים מזינים. בגלל iPSCs נגזר תא T כבר השתמש בהצלחה במחקר המחלה ^13,14, שיטה זו היא גם ישימה ושימושית ליצירת iPSCs הספציפית למחלה של חולים.

בין שיטות תכנות מחדש של תאי T, באמצעות וקטור וירוס סנדאי (שב) ככלי גן הוא שיטה שיכול ליצור iPSCs עם יעילות גבוהה ^7,16. בנוסף, בגלל sev הוא וירוס RNA חד-גדילים ולא צריך שלב DNA לשכפול, השימוש בו בדור iPSC ימנע שבירת הגנום מארח ^17-19. לכן, הקמנו פרוטוקולים ליצירת iPSCs מתאי T היקפיים אדם בסרום-frוקטורי EE וללא תנאי מזין באמצעות שילוב של matrigel, בינוני mTeSR, ושב.

Protocol

1. הכינו תאי T האדם הופעל לאסוף 10 מיליליטר heparinized כל דם מתורם על ידי venipuncture. קבלת הסכמה מדעת של תורמים מראש של venipuncture. Venipuncture חייב להיעשות על ידי טכנאי מוסמך ומיומן. ידית דגימות דם שהושגו עם ציוד סטרילי והנחיות בטיחות ביולוגית מתאימות הבאות. לדלל 10 מיליליטר heparinized כל דם עם 10 מיליליטר D-PBS (-). שים 15 מיליליטר פתרון Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל חדש. שכבת פתרון דם 20 מ"ל מוכן בשלב 1.2 על פתרון Ficoll בשלב 1.3. באמצעות פיפטה חשמלית, בואו פתרון דם מוכן בשלב 1.2 לרוץ לאט לאורך הקיר הפנימי של צינור. היזהר שלא לערבב את פתרון הדם ופתרון Ficoll. צנטריפוגה ב g × 400 למשך 30 דקות ב RT. קבע את מהירות האטת צנטריפוגלי ל" איטי ". הערה: לאחר צנטריפוגה, לבן דקשכבה עולה בין שכבה עליונה חלבית פלזמה ושכבה תחתונה Ficoll ברור. שכבה דקה לבנה זה מכילה תאי mononuclear. מעבירים את שכבת תא mononuclear לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש עם טפטפת 1 מ"ל. היזהר שלא כולל פתרון Ficoll. להוסיף D-PBS (-) לתאי mononuclear להיקף כולל של 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות על RT. בטל supernatant. להוסיף 10 מיליליטר של D-PBS (-) לתאי mononuclear, וצנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב RT. בטל supernatant, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום KBM502 לתאי mononuclear שנאספו, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. ניתן להשיג ב -5 × 10 6 תאי mononuclear מ -10 מיליליטר heparinized כל דם עם הפרדה מתאימה באמצעות Ficoll. הכן פתרון נוגדן CD3 אנטי אנושי בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בD-PBS (-). מוסיף את פתרון נוגדן CD3 אנטי האנושי לצלחת 6-היטב, להשרות את הגלישהאס של כל טוב, ודגירת הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור במשך לפחות 30 דקות. הסר את פתרון נוגדן CD3 אנטי אנושי מכל טוב ולשטוף פעם אחת עם D-PBS (-) רק לפני זריעת התאים. תאי mononuclear הזרע שהוכנו בשלב 1.9 בצפיפות של 2.5 × 10 5 תאים / 2 סנטימטר על 6 הצלחות גם מצופי נוגדן CD3 אנטי אנושי במדיום KBM502. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% -CO 2 ל3-7 ימים ללא שינוי בינוני עד שתאי T להגיע confluency. תאי T בתקופה זו הם גם תאים מושעים ודבקות. 2. תאי T להדביק אדם עם וקטורי sev אחרי תרבות 3-7 ימים, לאסוף את תאי T מופעלים עם קיים בינוני על ידי pipetting. העבר אותם לצינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות על RT. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר בינוני KBM502 טרי. ספירת התאים וצלחת 1.5 × 10 6 תאים (2 מיליליטר בינוני KBM502 טרי) לבאר כל צלחת 6-היטב מצופה נוגדן אנטי CD3. להפשיר את פתרונות sev של OCT3 / 4-sev / TSΔF, Sox2-sev / TSΔF, KLF4-sev / TSΔF, וc-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF על קרח. הוסף את פתרונות sev מכילים OCT3 / 4-sev / TSΔF, Sox2-sev / TSΔF, KLF4-sev / TSΔF, וc-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF בנפרד לבארות, כל אחד בריבוי של זיהום (משרד הפנים) 10. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% -CO 2 לשעה 24 נוספת. 3. הסר את וקטורי sev מתאי T האדם 24 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף את התאים הנגועים עם טפטפת. אם יש תאי דבקות, הם יכולים בקלות להיות מנותקים pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה. העבר אותם לצינור 15 מ"ל חרוטי, וצנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות על RT. הסר את supernatant המכיל וקטורי sev, ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני KBM502 טרי. תאי Replate בEACשעות של הבארות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% -CO 2 ל24 שעות נוספות. 4. תאי reseed על שכבת Matrigel הכן פתרון מטריצת קרום במרתף על ידי ג'ל מטריצת הפשרה (עיין ברשימת חומרים למותג הספציפי ששמש במחקר זה) על 4 מעלות צלזיוס והמסת 0.2 מיליליטר ב 10 מיליליטר של מדיום / F12 DMEM. הערה: מטריקס ג'ל (עיין ברשימת חומרים למותג הספציפי ששמש במחקר זה) צריכה להפשיר O / N ב 4 ° C להיות מופשרים לחלוטין. שמור את זה על קרח עד ממש לפני השימוש. צלחת פתרון 5 מיליליטר מטריצת קרום במרתף לכל צלחת למאכלי 100 מ"מ ולהשאיר על RT לפחות 30 דקות לפני זריעת תאים. לפחות שתי מנות של 100 מ"מ יש צורך בניסוי אחד. איסוף תאים נגועים sev ידי pipetting, להעביר אותם לצינור 15 מ"ל חרוטי, וצנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר בינוני KBM502 טרי. לספור את מספר לספירהLLS באמצעות hemocytometer, להסיר את פתרון מטריצת קרום במרתף ממנות 100 מ"מ מוכנים בשלב 4.2 וצלחת 1 × 10 5 ו 1 × 10 6 תאים (10 מיליליטר בינוני mTeSR טרי) על קרום במרתף 100 מ"מ מטריצה ​​מצופה מנות. לבסוף, השתמש בצלחת שבמושבות בקלות הרימו. דגירה הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% -CO 2 O חממה / N. לשנות הבינוני עד 10 מיליליטר בשר בינוני mTeSR בכל יום אחר. הערה: כ 20-30 ימים לאחר הדבקה, מושבות שדומות מאוד לתאי גזע עובריים (ESCs) יופיע. 5. להרחיב iPSCs תאים שמקורם T הכן פתרון מטריצת קרום במרתף על ידי ג'ל מטריצת הפשרה (עיין ברשימת חומרים למותג הספציפי ששמש במחקר זה) על 4 מעלות צלזיוס והמסת 0.2 מיליליטר ב 10 מיליליטר של מדיום / F12 DMEM. צלחת 1 מיליליטר של פתרון מטריצת קרום במרתף בכל טוב בצלחת 6 היטב ולהשאיר על RT בלפחות 30 דקות לפני בחירת מושבות. מלא את צלחת 96-היטב עם 20 μl של מדיום mTeSR בכל טוב. בחר מושבות שדומות ESCs תחת סטראו בעזרת פיפטה 20 μl. הערה: המושבות של ESCs וiPSCs עגולות ושטוחות, כפי שמוצגים באיור 1. מושבות העברה נבחרו ל96-גם הצלחת מלאה בינוני mTeSR בשלב 5.3. הוסף 200 μl של מדיום mTeSR היטב כל אחד ובזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את המושבה לגושים קטנים תחת סטראו בעזרת פיפטה 200 μl. הסר את פתרון מטריצת קרום במרתף ממוכן היטב ב5.2 ואת כל מושבה ולאחת מצלחת 6-היטב מצופה מטריצת הקרום במרתף עם 2 מיליליטר של מדיום mTeSR בכל טוב. לשנות הבינוני עד 2 מיליליטר בשר בינוני mTeSR בכל יום אחר. 6. שמרו על iPSCs תאים שמקורם T יכול להישמר iPSCs התאים שמקורם Tומאוחסן באמצעות אותן טכניקות כמו לiPSCs האנושי וESCs אדם. ברגע שמושבות iPSC לגדול, להרחיב אותם לכלים גדולים יותר על ידי חזרה על אותו התהליך. לשנות את מדיום mTeSR כל 1-2 ימים. כאשר המושבות הפכו מחוברות כל 5-7 ימים, מעבר התאים באמצעות פתרון ניתוק לiPSCs האנושי וESCs אדם על פי הוראות היצרן.

Representative Results

שימוש בפרוטוקול זה, משתמשים יכולים ליצור iPSCs מתאי T היקפיים אנושיים ביציבות. דור iPSC מתאי T עם sev וmatrigel הראה כ 0.002% -. 0.005% מיעילות של תכנות מחדש של תאים בכמה מקרים בין תורם ושב לא התגלו לאחר כמה קטעים 16 איור 1A מראה סכמטי של הפרוטוקול להפקת T תא נגזר iPSCs בתנאים ללא מזין באמצעות matrigel ובינוני mTeSR. סביב 20-30 ימים לאחר הדבקה עם sev, מושבות iPSC מוכרות על ידי המורפולוגיה כמו המושבה-ESC (איור 1). מכתים immunofluorescence חשף ביטוי של סמני תא pluripotent טיפוסיים (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, וTRA-1-81) בiPSCs תאים שמקורם T שנוצרו בתנאים ללא מזין (איור 1 ג). "= רוחב" 700 "/> איור 1. (א): סכמטי של הפרוטוקול לתאי T תכנות מחדש בתנאים ללא מזין במחקר זה. (ב): מושבה iPSC כמו ESC טיפוסי ביום 27 אחרי דגימת דם בתנאים ללא מזין. (ג): צביעת ALP ומכתים immunofluorescence עבור סמני pluripotency ומשטח (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, וTRA-1-81) בiPSCs תאים שמקורם T שנוצרו בתנאים ללא מזין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors¹⁶. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.

SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction^20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine¹⁶.

Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection^25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus⁶. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.

The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now^27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.

There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.

Materials

Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-02
Purified NA/LE mouse anti-human CD3	BD Pharmingen	555336
KBM502 medium	KOHJIN BIO	16025020	Warm in 37 ℃ water bath before use
Bovine albumin fraction V solution	Gibco	15260-037
BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230	Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes
mTeSR1 medium kit	STEM CELL	5850	Warm at room temperature before use
Dissociation Solution	ReproCELL	RCHETP002
D-PBS(–)	Wako	045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0	DNAVEC	DV-0303c	Thaw on ice before use
100-mm tissue culture dish	Falcon	353003
96-well tissue culture plate	Falcon	353078
6-well tissue culture plate	Falcon	353046
15ml Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	188271
50ml Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	227261