This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.
최근 iPSCs 회생 치료를위한 세포를 새로운 소스로서 주목 받고있다. 생성 iPSCs의 초기 방법은 침습적 조직 검사와 유전자의 레트로 바이러스 게놈에 삽입하여 얻은 피부 섬유 아세포에 의존하지만, 이러한 단점을 피하기에 많은 노력을 기울이고있다. 인간 말초 T 세포를 생성 iPSCs 고유 셀 소스이다. T 세포로부터 유래 iPSCs는 T 세포 수용체 (TCR) 유전자의 재 배열을 포함하고 항원 특이 적 T 세포의 근원이다. 또한, 게놈의 T 세포 수용체 재배치 개별 세포주 라벨 및 이식 공여자 세포를 구별 할 수있는 잠재력을 갖는다. iPSCs의 안전한 임상 적용의 경우, 유해한 제제에 새롭게 생성 iPSCs 노출의 위험을 최소화하는 것이 중요하다. 소 태아 혈청 및 피더 세포가 다 능성 줄기 세포 배양에 필수적인 하였지만, 이것은 위험을 줄이기 위해 배양 시스템에서 제거하는 것이 바람직하다예측할 수없는 병원성의. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 정의되지 않은 병원체에 iPSCs 노출의 위험을 줄이기 위해 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs를 생성하기위한 프로토콜을 확립했다. 센다이 바이러스를 처리하는 것이 적절한 바이오 레벨 장비가 필요하지만, 센다이 바이러스가 감염 게놈 삽입없이 T 세포를 활성화하면서도 고효율. 이 프로토콜에서는 활성화 된 T 세포 배양 및 센다이 바이러스의 조합을 이용하여 피더가없는 조건에서 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs의 생성을 보여준다.
iPSCs는 재생 의학 1-3 세포의 획기적인 소스로 주목을 받고있다. 현재까지 iPSCs를 생성 다양한 방법들이 4,5보고되었다. 이들 중에서, 인간 T 세포로부터 생성되는 세포 iPSCs 때문에 샘플링 6-8의 덜 침습적 방법의 특별한 관심왔다. 또한 T 세포로부터 유래 iPSCs는 T 세포 수용체 (TCR) 유전자의 재 배열을 포함하며, 따라서 항원 특이 적 T 세포 9,10의 근원이다. 따라서, T 세포 유래 iPSCs를 생성 안전하게 재생 의학을 진행하는 데 유용합니다.
이 방법은 예측 불가능한 병원성의 위험을 감소시키는 개념에 기초한다. iPSCs의 안전한 임상 응용을 위해 그것을 11은 병원균에 대한 노출의 위험을 줄이는 것이 중요하다. 이미 다 능성 줄기 세포의 배양 많은 시스템에서, 소 태아 혈청과 피더 세포를 필수적 시약으로서 사용되어왔다12이야. IPSC 생성 예측할 병원성의 위험을 감소시키기 위해 그러나, 배양 시스템에서 이러한 두 시약의 제거가 바람직하다.
또한,이 방법은 환자와 피더 세포의 제조에서 힘드는 침습적 셀 샘플링을 피할 수있는 장점이있다. T 세포 유래 iPSCs 이미 질병 연구 (13, 14)에 성공적으로 사용 되었기 때문에,이 방법은 환자의 질환 별 iPSCs를 생성 적용 가능하고 유용하다.
유전자 차량으로 센다이 바이러스 (SEV) 벡터를 사용하여 T 세포의 리 프로그래밍 방법 중 고효율 7,16과 iPSCs를 생성 할 수있는 방법이다. SEV는 단일 – 가닥 RNA 바이러스이고, DNA 복제 단계가 필요하지 않기 때문에 또한, IPSC 세대에서의 사용은 숙주 게놈 17-19 속보 피한다. 따라서 혈청 FR에서 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs를 생성하기위한 프로토콜을 확립EE 및 마트 리겔, mTeSR 매체의 조합을 이용하여 피더가없는 조건, SEV 벡터.
We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.
SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.
Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.
The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.
There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.
The authors have nothing to disclose.
우리는 기술 지원을 의학의 게이오 대학에서 요시코 미야케, 사야카 Kanaami, Chihana 후지타, 미호 야마구치, 나츠코 Henmi 및 레이 오노 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 건강 연구 성과의 실용화를 촉진하기 위해 R & D 시스템 지원 프로그램, 및 재생 의학의 실현을위한 고속도로 프로그램에 의해 투자되었다.
Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
KBM502 medium | KOHJIN BIO | 16025020 | Warm in 37 ℃ water bath before use |
Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes |
mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
15ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
50ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |