प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों का उपयोग कर Murine, मानव और सुअर उत्पत्ति के जीवित कोशिकाओं में Intracellular जीन एक्सप्रेशन की जांच
Summary
This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
Abstract
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
Introduction
2006 में, एक उपन्यास दृष्टिकोण एक pluripotent राज्य में दैहिक कोशिकाओं reprogram को वर्णित किया गया था। संभावित reprogramming की एक सरणी के prescreening बाद murine fibroblasts सफलतापूर्वक प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (आईपीएस) रेट्रोवायरल पारगमन और चार प्रतिलेखन कारक की overexpression द्वारा तथाकथित करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है कारकों (Oct4, Sox2, Klf4, सी Myc) 1। इसके बाद इस तकनीक को प्रभावी ढंग से मनुष्य 2, बंदरों 3, चूहों 4, कुत्तों 5, भेड़ 6 और सूअरों 7 सहित विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों में से दैहिक कोशिकाओं का उपयोग कर reproduced किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को छोड़ते हुए या MYC 8, 9 प्रकाशित किया गया है सी संभावित ऑन्कोजेनिक प्रतिलेखन कारक की जगह संशोधित।
भले ही प्रारंभिक reprogramming की बढ़ती कालोनियों का सच pluripotency, एक श्रमसाध्य और समय लेने वाला काम इस बात की पुष्टि हो गया है दृष्टिकोण। एक बड़ी खामीइन विश्लेषण के बहुमत की वे जीवित कोशिकाओं पर नहीं किया जा सकता है। ऐसे OCT4, Sox2, NANOG या REX1 के रूप में स्थापित pluripotency कारकों नाभिक में स्थित प्रतिलेखन कारक प्रतिनिधित्व करते हैं और उनकी पहचान आरटी पीसीआर विश्लेषण 10 के लिए immunohistochemistry या सेल करने के लिए पूर्व कोशिकाओं के निर्धारण की आवश्यकता है -। 12 इसके बाद इन कोशिकाओं को भविष्य के लिए खो रहे हैं प्रत्येक कॉलोनी के दोहराने संस्कृतियों की आवश्यकता होती है प्रयोगों।
इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं पर pluripotency का विश्लेषण करने के लिए एक प्रौद्योगिकी अति आवश्यक है। कई दृष्टिकोण वास्तव में झिल्ली आधारित एंटीजन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं पर सीधे किया जा सकता है (उदाहरण। टीआरए-1-60, SSEA4) 12, फ्लोरोसेंट विशेष रूप से भ्रूण स्टेम लेबल जो alkaline फॉस्फेट 13 या छोटे अणुओं का पता लगाने के रंगों की सूचना दी (ते) और आईपीएस कोशिकाओं 14। हालांकि, एंटीबॉडी फिर भी प्रतिकूल कोशिकाओं और प्रत्येक मेथ प्रभावित हो सकती हैआयुध डिपो के लिए एक एकल pluripotency मार्कर के लिए प्रतिबंधित है। अंत में, फ्लोरोसेंट आणविक बीकन, कोशिकाओं का जीना धुंधला अनुमति है, जो बाल के लिये कांटा संरचनाओं, साथ दोहरे antisense oligonucleotides, 15 में वर्णित किया गया है। इस दृष्टिकोण कई जीनों को लागू किया जा सकता है, तकनीक से बढ़ आईपीएस कालोनियों के लिए लागू नहीं है, जो एक एकल कक्ष निलंबन, की nucleofection की आवश्यकता है।
कुछ साल पहले जीन विशिष्ट नैनोकणों मानव SKBR3 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 16 में survivin अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए वर्णित किया गया है। यह पांडुलिपि सोने nanoparticle conjugates के उपयोग के माध्यम से लाइव ते और आईपीएस कोशिकाओं में pluripotency मार्कर का पता लगाने के लिए एक उपन्यास नवीन दृष्टिकोण का वर्णन है। ये नैनोकणों पूरक आरएनए अनुक्रम और एक Cy3 लेबल संवाददाता किनारा लेकर जा रही एक युग्मित कब्जा किनारा के साथ एक केंद्रीय सोने के कण से मिलकर बनता है। संवाददाता कतरा के फ्लोरोसेंट संकेत केंद्रीय सोने के कण से बुझती है। इसके अलावा, उचितनैनोकणों के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण, क्रमशः (चित्रा 1) सेवा करते हैं। (चित्रा 3) एक आवेदन के लिए नैनोकणों बस संस्कृति के माध्यम से (चित्रा 2) से जुड़ जाते हैं और endocytosis के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश। लक्ष्य शाही सेना व्यक्त किया जाता है, तो यह तो एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन करता है जो रिपोर्टर कतरा विस्थापित। इस विधि लक्ष्य सेल और लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर जीवित कोशिकाओं में सीधे एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे ऑप्टिकली नजर रखी जा सकती आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, प्रौद्योगिकी आईपीएस कोशिकाओं के मामले में प्रजातियों भर में किसी भी वांछित लक्ष्य जीन के लिए लागू किया जा सकता है और इस तरह के कई अलग अलग क्षेत्रों में अनुसंधान नियोजित किया जा सकता है। अंत में, प्रवाह cytometric Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन की अनुमति देने का विश्लेषण करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान कार्य सीधे एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे विविध histogenetic मूल के साथ अलग स्तनधारी प्रजातियों में से जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर जीन की अभिव्यक्ति का विश्वसनीय मूल्यांकन की अनुमति है जो प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों के उपयोग का वर्णन। यह दृष्टिकोण अन्य प्रकाशित तरीकों की तुलना में लाभ की एक जोड़ी है। सभी शोधकर्ता का पहला लक्ष्य जीन या सेल प्रकार या तो सम्मान के साथ सीमित नहीं है। सभी प्रतिरक्षी आधारित तरीकों का पता लगाने के लिए एक एकल मिलान करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं। फ्लोरोसेंट आणविक बीकन भी जीन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए तैयार किया जा सकता है, इस विधि कोशिकाओं और बाद में nucleofection 15 की हदबंदी की आवश्यकता है। इसके विपरीत, जीन विशिष्ट नैनोकणों के आवेदन को सक्रिय रूप से endocytosis द्वारा नैनोकणों समाई है जो लक्ष्य सेल के किसी भी हेरफेर की आवश्यकता नहीं है। बाद में passaging के दौरान सोने के कणों धीरे-धीरे कोशिकाओं को छोड़ने और संस्कृति downstrea में इस्तेमाल किया जा सकतामीटर प्रयोगों।
फिर भी, तकनीक भी अभी भी कुछ सीमाएं हैं। कुछ मार्कर के कारण इस तरह के SSEA -1 या टीआरए-1-81 के रूप में 20 उनके कार्बोहाइड्रेट प्रकृति को स्पष्ट रूप से पहचाने जाने नहीं हैं। वर्तमान में, नैनोकणों के एक बड़े सरणी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। इन कणों सेलुलर प्रयोगों में उनकी कार्यक्षमता के लिए pretested कर दिया गया है। वर्तमान कार्य के उद्देश्य प्रजातियों सीमाओं के पार इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अनुकूलित जांच करने के लिए डिजाइन किया गया था। एक उपन्यास लक्ष्य जीन एक के लिए एक जांच डिजाइन जब इस तरह के एक दृष्टिकोण के बाद या जब सिलिको में एक की कार्यक्षमता की जांच अच्छी तरह से इन विट्रो में मूल्यांकन किया जाना चाहिए भविष्यवाणी की है कि बारे में पता होना चाहिए। NANOG-SF1 एक murine में बेमेल का आधार है और सुअर का अनुक्रम के साथ एक अच्छा प्रतिदीप्ति संकेत उत्पादन किया, जबकि अनुक्रम समरूपता के लिए एक 100% अनुरूपता पता चला है जो NANOG-SF3 जांच बिल्कुल काम नहीं किया था। एक अन्य प्रश्न के नैनोकणों कुशल तेज करने के लिए संदर्भित करता है। कणों दर्जendocytosis, नैनोकणों 21 के आकार से प्रभावित है जो एक प्रक्रिया के द्वारा कोशिकाओं, सेल प्रकार और भेदभाव का दर्जा 22 और सेलुलर क्षमता phago- प्रदर्शन और 23 macropinocytosis करने के लिए। एक संतोषजनक प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए इष्टतम एकाग्रता प्रत्येक व्यक्ति आवेदन या सेल लाइन के लिए परीक्षण किया जाना है। कि अंत करने के लिए, पहला प्रयोग हमेशा लक्ष्य विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने पर जाने से पहले सेल प्रकार और संस्कृति की स्थिति के भीतर जांच की अनुकूलता का मूल्यांकन करने के लिए तेज नियंत्रण के आवेदन होना चाहिए।
एक उपन्यास सेल लाइन के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने या सेल की आबादी उचित नियंत्रण का समावेश है जब एक महत्वपूर्ण बिंदु विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए। कभी fluorescing तेज नियंत्रण नैनोकणों की सांद्रता लक्ष्य सेल की आबादी में एक पर्याप्त फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित करेगा, जो एक संकेत प्रदान करेगा। प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन किया जाना चाहिएघ संकेत के रूप में अगले दिन के समय 17 के साथ खत्म हो जाएगा। एक ही समय में एक समान एकाग्रता पर लागू यूकेरियोटिक जीनोम में एक समकक्ष के बिना हाथापाई नियंत्रण एक नगण्य पृष्ठभूमि संकेत के लिए प्रेरित करना चाहिए। एक तिहाई नियंत्रण के रूप में यह एक एक गृह व्यवस्था जीन के लिए विशिष्ट nanoparticle (जैसे GAPDH, β-actin) का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। ये नैनोकणों दृष्टिकोण चयनित लक्ष्य सेल की आबादी में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। इन पर नियंत्रण से बाहर कर देते हैं संतोषजनक एक अन्य लक्ष्य जीन के लिए विशिष्ट नैनोकणों का उपयोग कर विश्वसनीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेतों को प्राप्त करने की उम्मीद कर सकते हैं। वे लक्ष्य अनुक्रम 24 नीचे विनियमित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में लागू नैनोकणों की एकाग्रता भी महत्वपूर्ण हो सकता है। हालांकि, इस आशय यहाँ (400 बजे) प्रस्तुत प्रयोगों में इस्तेमाल सांद्रता तुलना में बहुत अधिक सांद्रता (5 एनएम) की आवश्यकता है। इस एकाग्रता nanofla पररिस लक्ष्य जीन mRNA या प्रोटीन का स्तर और HEK293 और murine ES कोशिकाओं 17 के प्रसार को ख़राब नहीं है 2 एनएम के रूप में उच्च सांद्रता को प्रभावित नहीं करते। इसके अलावा, एक पूरे जीनोम अभिव्यक्ति विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति 25 में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का खुलासा नहीं किया। इसलिए, 1 एनएम के लिए ऊपर सांद्रता में nanoflares किसी भी महत्वपूर्ण प्रतिकूल प्रभाव का प्रदर्शन नहीं करना चाहिए।
इस तकनीक का एक बहुत ही होनहार आवेदन एक विशेष जीन द्वारा चिह्नित किया गया है, जो किसी भी सेल की आबादी लेबल करने के लिए संभावना है। हाल ही में, जीन विशिष्ट नैनोकणों सफलतापूर्वक चुनिंदा लाइव वेंट्रिकुलर myocytes 26, मेलेनोमा कोशिकाओं 27 की उप-जनसंख्या दाग इस्तेमाल किया गया है, 28 और अनुमस्तिष्क सेल संस्कृतियों 29 monocytes। इस तरह के प्रतिदीप्ति चिह्नित सेल आबादी और हल के रूप में जीवित कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में पशु मॉडल में लाइव मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने की कल्पना हैसीईए की उनकी अभिव्यक्ति, जीन या लक्ष्य संरचनाओं को बढ़ावा देने के संभावित मेटास्टेसिस की खोज के लिए सबसे अधिक मूल्यवान पर आधारित है। हमने हाल ही में वास्तव में reprogrammed murine आईपीएस कालोनियों का पता चला प्रतिदीप्ति तीव्रता 17 के आधार पर Nanog -specific नैनोकणों के साथ बगल में पहचाना जा सकता है कि पता चला है। इसलिए, सही मायने में reprogrammed आईपीएस कालोनियों की पहचान के सबसे होनहार कालोनियों की पहचान करने के लिए रोबोट प्रतिदीप्ति का पता लगाने और उठा उपकरणों का उपयोग करें, जो उच्च throughput प्लेटफार्मों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रौद्योगिकी के विशिष्ट सेलुलर उप-जनसंख्या का चयन करने के लिए कई शोध क्षेत्रों में उपयुक्त प्रतीत होता है और यह उच्च throughput प्लेटफार्मों में नैनोकणों लागू करने के लिए संभव लगता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में सीधे इंट्रासेल्युलर जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अनुमति देता है जो प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों का उपयोग कर एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। यह तकनीक एक, शुद्ध विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण है और आगे चरित्र हो सकता हैकई क्षेत्रों में अनुसंधान दुर्लभ सेलुलर उप-जनसंख्या ize।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
Materials
| DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
| Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
| Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
| DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
| Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
| MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
| 0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
| Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
| Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
| E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
| EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
| Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
| Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
| BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
| Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
| FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |
References
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