This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
Nel 2006, un nuovo approccio è stato descritto per riprogrammare le cellule somatiche in uno stato pluripotente. Dopo preselezione di una serie di fattori di potenziale riprogrammazione fibroblasti murini potrebbero essere convertiti con successo alle cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) di trasduzione retrovirale e sovraespressione di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Successivamente questa tecnica è stata efficacemente riprodotto utilizzando cellule somatiche di diverse specie di mammiferi, tra cui gli esseri umani 2, scimmie 3, ratti, cani 4 5 6, pecore e maiali 7. Inoltre, modificati i protocolli omettendo o sostituzione del fattore di trascrizione potenzialmente oncogenico c- MYC sono stati pubblicati 8, 9.
Indipendentemente dalla riprogrammazione iniziale avvicinarsi al vero pluripotenza crescita di colonie deve essere confermata, un'operazione laboriosa e richiede molto tempo. Un grave inconvenientedella maggior parte di queste analisi è che non possono essere eseguite su cellule vive. Fattori pluripotenza affermati come OCT4, SOX2, Nanog o REX1 rappresentano fattori di trascrizione si trova nel nucleo e la loro rilevazione richiede la fissazione delle cellule prima di immunoistochimica o lisi cellulare per RT-PCR analisi. 10 – 12 In seguito, queste cellule sono perse per il futuro esperimenti che richiedono culture repliche di ciascuna colonia.
Così, una tecnologia per analizzare pluripotency su cellule vive è altamente desiderabile. Diversi approcci possono infatti essere eseguite direttamente sulle cellule vive utilizzando anticorpi diretti contro antigeni basato membrana (ad es. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente riferito coloranti per rilevare fosfatasi 13 o piccole molecole alcaline che specificamente etichettano staminali embrionali (ES) e cellule iPS 14. Tuttavia, gli anticorpi possono tuttavia alterare le cellule e ogni method è limitato a un solo marcatore pluripotenza. Infine, segnali molecolari fluorescenti, oligonucleotidi antisenso doppia forcella con strutture che consentono colorazione vivo di cellule, sono stati descritti 15. Sebbene questo approccio può essere applicato a molti geni, la tecnica richiede nucleofection di una sospensione di cellule singole, che non è applicabile alle crescenti iPS colonie.
Un paio di anni fa nanoparticelle gene-specifici sono stati descritti per analizzare l'espressione survivina in SKBR3 cellule di carcinoma mammario umano 16. Questo manoscritto descrive un approccio innovativo romanzo di individuare marcatori pluripotenza in ES live e le cellule iPS attraverso l'utilizzo di nanoparticelle d'oro coniugati. Queste nanoparticelle costituite da una particella centrale oro con un filo di cattura accoppiato trasporta la sequenza di RNA complementare e una ciocca giornalista Cy3-marcato. Il segnale fluorescente del filamento giornalista si spegne dalla particella oro centrale. Inoltre, appropriatananoparticelle servono come controlli negativi e positivi, rispettivamente (Figura 1). Per un'applicazione nanoparticelle sono semplicemente aggiunti al mezzo di coltura (Figura 2) ed entrano nelle cellule tramite endocitosi (Figura 3). Se RNA bersaglio è espresso sposta il filamento giornalista che poi emette un segnale fluorescente. Questo metodo non richiede la manipolazione della cellula bersaglio e l'espressione del gene bersaglio può essere monitorato otticamente sotto un microscopio a fluorescenza direttamente in cellule vive. Inoltre, la tecnologia può essere applicata a qualsiasi gene bersaglio desiderato tra le specie nel caso di cellule iPS e quindi può essere impiegato in molte aree di ricerca diverse. Infine, citometria a flusso analizza consentire l'identificazione e l'arricchimento di cellule positive Cy3.
Il presente lavoro descrive l'uso di fluorescenza etichettati nanoparticelle che consentono la valutazione affidabile dell'espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive di diverse specie di mammiferi con diversa origine istogenetica sotto un microscopio a fluorescenza. Questo approccio ha un paio di vantaggi rispetto ad altri metodi pubblicati. Innanzitutto il ricercatore non è limitato in relazione sia gene bersaglio o tipo cellulare. Tutti i metodi di rilevamento di anticorpi base sono limitati a un singolo epitopo. Sebbene beacon molecolari fluorescenti possono anche essere progettati per un ampio spettro di geni, questo metodo richiede la dissociazione delle cellule e la successiva nucleofection 15. Al contrario, l'applicazione di nanoparticelle gene-specifici non richiede alcuna manipolazione della cellula bersaglio che avvolge le nanoparticelle attivamente per endocitosi. Durante la successiva passaging le particelle d'oro gradualmente lasciano le cellule e la cultura possono essere utilizzati in downstream esperimenti.
Tuttavia, anche la tecnologia presenta ancora alcuni limiti. Alcuni marcatori non sono ovviamente rilevabili causa della loro natura di carboidrati come SSEA-1 o TRA-1-81 20. Attualmente, una vasta gamma di nanoparticelle è disponibile in commercio. Queste particelle sono state pre-testato per la loro funzionalità in esperimenti cellulari. L'obiettivo del presente lavoro è stato quello di progettare sonde personalizzate che possono essere utilizzati tra le specie delle frontiere. Quando si seguono un tale approccio o quando si progetta una sonda per un romanzo un gene bersaglio deve essere consapevoli del fatto che la funzionalità di un in silico predetto sonda deve essere attentamente valutata de vitro. La sonda Nanog-SF3 che ha mostrato una omologia del 100% per l'omologia sequenza non ha funzionato affatto, mentre Nanog-SF1 con una base non corrispondenti nel murino e la sequenza suina ha prodotto un segnale di bel fluorescenza. Un'altra questione riguarda l'assorbimento efficiente delle nanoparticelle. Le particelle entranole cellule per endocitosi, un processo che è influenzata dalle dimensioni delle nanoparticelle 21, il tipo di cellula e lo stato di differenziazione 22 e la capacità cellulare per eseguire phago- e macropinocitosi 23. La concentrazione ottimale per ottenere un segnale di fluorescenza soddisfacente deve essere testati per ogni singola applicazione o linea cellulare. A tal fine, il primo esperimento deve sempre essere l'applicazione del controllo assorbimento di valutare la compatibilità delle sonde all'interno dei tipi di cellule e condizioni di coltura prima di passare rilevazione dell'espressione genica specifica destinazione.
Un punto critico per ottenere risultati affidabili quando si applica questo protocollo per una linea cellulare romanzo o popolazione di cellule è l'inclusione di controlli adeguati. Il controllo assorbimento mai fluorescenti fornirà una indicazione che le concentrazioni di nanoparticelle indurranno un segnale fluorescente sufficiente nella popolazione di cellule bersaglio. La fluorescenza deve essere valutared il giorno successivo, il segnale si esaurirà con il tempo 17. Allo stesso tempo, il controllo corsa senza un omologo nel genoma eucariotico applicata ad una concentrazione identica deve indurre un segnale di fondo trascurabile. Come terzo controllo è consigliabile utilizzare una nanoparticella specifica per un gene housekeeping (GAPDH esempio, β-actina). Queste nanoparticelle servono come controllo positivo che l'approccio può essere utilizzato per rilevare l'espressione genica specifica nella popolazione di cellule bersaglio selezionato. Se questi controlli risultano una soddisfacente si può aspettare di ottenere segnali fluorescenti specifiche affidabili utilizzando nanoparticelle specifici per altri geni bersaglio. La concentrazione delle nanoparticelle applicate può anche essere critico come hanno dimostrato di down-regolare la sequenza bersaglio 24. Tuttavia, questo effetto richiede concentrazioni molto più elevate (5 nM) rispetto alle concentrazioni usate negli esperimenti qui presentati (400 pM). A questa concentrazione il nanoflares non influiscono gene bersaglio mRNA o livelli di proteine e concentrazioni elevate come 2 nm non compromettere la proliferazione di HEK293 e cellule ES murine 17. Inoltre, tutta una analisi di espressione del genoma non ha rivelato cambiamenti significativi nell'espressione genica 25. Pertanto, a concentrazioni fino a 1 nM le nanoflares non devono presentare alcun effetto avverso importanti.
Un'applicazione molto promettente di questa tecnologia è la possibilità di etichettare qualsiasi popolazione di cellule che è caratterizzato da un gene specifico. Recentemente, nanoparticelle gene-specifici sono stati utilizzati con successo per colorare selettivamente miociti ventricolari in diretta 26, sottopopolazioni di cellule di melanoma 27, 28 e monociti cellulari cerebellare culture 29. Tali popolazioni di cellule fluorescenza marcati possono essere ordinati e purificati mediante citometria a flusso delle cellule come vive. Nel campo dell'oncologia è immaginabile per isolare le cellule tumorali metastatiche vivo in modelli animalisulla base della loro espressione di CEA, più prezioso per la ricerca del potenziale metastasi promuovere geni o strutture bersaglio. Abbiamo recentemente dimostrato che veramente riprogrammati murine iPS colonie possono essere identificati in situ con Nanog nanoparticelle specifico d'basati sulla fluorescenza rilevata 17. Pertanto, l'identificazione delle colonie IPS veramente riprogrammati potrebbe essere eseguita su piattaforme high throughput, che utilizzano il rilevamento della fluorescenza robotica e dispositivi di prelievo per identificare le colonie più promettenti. Questa tecnologia sembra essere adatto in molte aree di ricerca per selezionare sottopopolazioni cellulari specifici e sembra possibile applicare le nanoparticelle nelle piattaforme high throughput. In conclusione, questo protocollo rappresenta un nuovo approccio con fluorescenza etichettati nanoparticelle che permette la rilevazione dell'espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive. Questa tecnologia può essere un valido strumento per purificare, espandere e ulteriore carattereize sottopopolazioni cellulari rare in molte aree di ricerca.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |