This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
En 2006, un nuevo enfoque fue descrito para reprogramar células somáticas en un estado pluripotente. Después de la preselección de una matriz de potencial reprogramación factores de fibroblastos murinos se podrían convertir con éxito a la denominada células madre pluripotentes inducidas (iPS) por transducción retroviral y la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Posteriormente esta técnica efectivamente se ha reproducido utilizando células somáticas de las diferentes especies de mamíferos, incluyendo seres humanos 2, monos, ratas 3 4, 5 perros, ovejas y cerdos 6 7. Además, modificado protocolos omitir o sustituir el factor de transcripción c-MYC potencialmente oncogénico se han publicado 8, 9.
Independientemente de la reprogramación inicial de acercarse a la verdad pluripotencia de las colonias en crecimiento tiene que ser confirmado, una tarea laboriosa y requiere mucho tiempo. Un inconveniente importantede la mayoría de estos análisis es que no se pueden realizar en células vivas. Factores de pluripotencia establecidos, tales como Oct4, Sox2, NANOG o REX1 representan factores de transcripción localizados en el núcleo y su detección requiere la fijación de las células antes de la inmunohistoquímica o la lisis celular para el análisis de RT-PCR 10 -. 12 Después de esto, estas células se pierden para el futuro experimentos que requieren cultivos replicados de cada colonia.
Por lo tanto, una tecnología para analizar la pluripotencia en células vivas es altamente deseable. Varios enfoques de hecho se pueden realizar directamente en células vivas utilizando anticuerpos dirigidos contra antígenos basados en membranas (por ejemplo. TRA-1 a 60, SSEA4) 12, fluorescente informó colorantes para detectar fosfatasa 13 o moléculas pequeñas alcalinos que etiquetan específicamente madre embrionarias (ES) y las células iPS 14. Sin embargo, los anticuerpos pueden, sin embargo, afectar adversamente a las células y cada metod está restringido a un único marcador de pluripotencia. Por último, las balizas moleculares fluorescentes, los oligonucleótidos de doble antisentido con estructuras de horquilla, que permiten tinción en vivo de las células, se han descrito 15. Aunque este enfoque puede ser aplicado a muchos genes, la técnica requiere nucleofection de una única suspensión celular, que no es aplicable a las crecientes iPS colonias.
Hace un par de años las nanopartículas de genes específicos se han descrito para analizar la expresión de survivina en células de cáncer de mama SKBR3 humanos 16. Este manuscrito describe un nuevo enfoque innovador para la detección de marcadores de pluripotencia en ES vivos y las células iPS a través del uso de conjugados de nanopartículas de oro. Estas nanopartículas se componen de una partícula central de oro con una cadena de captura unido lleva la secuencia de ARN complementaria y una hebra reportero marcado con Cy3. La señal fluorescente de la hebra reportero se inactivó mediante la partícula de oro central. Además, apropiadonanopartículas sirven como controles negativos y positivos, respectivamente (Figura 1). Para una aplicación de las nanopartículas simplemente se añaden al medio de cultivo (Figura 2) y entran en las células a través de endocitosis (Figura 3). Si se expresa el ARN diana que desplaza la hebra reportero que entonces emite una señal fluorescente. Este método no requiere la manipulación de la célula diana y la expresión del gen diana se puede monitorizar ópticamente bajo un microscopio de fluorescencia directa en células vivas. Además, la tecnología se puede aplicar a cualquier gen diana deseada a través de especies en el caso de las células iPS y por lo tanto se puede emplear en muchas áreas de investigación diferentes. Finalmente, los análisis de citometría de flujo permite la identificación y el enriquecimiento de células positivas Cy3.
El presente trabajo describe el uso de marcado con fluorescencia nanopartículas que permiten la evaluación fiable de la expresión génica intracelular directamente en células vivas de diferentes especies de mamíferos con diverso origen histogenético bajo un microscopio de fluorescencia. Este enfoque tiene un par de ventajas en comparación con otros métodos publicados. En primer lugar el investigador no está limitado con respecto a cualquiera de los genes diana o tipo de célula. Todos los métodos de detección de anticuerpos basados están restringidas a un solo epítopo. Aunque fluorescentes balizas moleculares también pueden diseñarse para un amplio espectro de genes, este método requiere la disociación de las células y la posterior nucleofection 15. En contraste, la aplicación de nanopartículas de genes específicos no requiere ningún tipo de manipulación de la célula diana que envuelve las nanopartículas activamente por endocitosis. Durante la posterior pases las partículas de oro dejan gradualmente las células y el cultivo se pueden utilizar en downstream experimentos.
Sin embargo, la tecnología también todavía tiene algunas limitaciones. Algunos marcadores, obviamente, no son detectables debido a su naturaleza carbohidrato tal como SSEA-1 o TRA-1-81 20. En la actualidad, una gran variedad de nanopartículas está disponible comercialmente. Estas partículas han sido previamente probado por su funcionalidad en los experimentos celulares. El objetivo del presente trabajo fue diseñar sondas personalizadas que se pueden utilizar en todas las especies de las fronteras. Al seguir este tipo de enfoque o en el diseño de una sonda para un nuevo gen diana uno tiene que ser consciente de que la funcionalidad de un in silico predijo la sonda debe ser evaluado a fondo en vitro. La sonda NANOG-SF3 que mostró una homología del 100% a la homología de secuencia no funcionaba en absoluto mientras NANOG-SF1 con una sola base de no coincidentes en el murino y secuencia porcina produce una señal de fluorescencia agradable. Otra cuestión se refiere a la absorción eficiente de las nanopartículas. Las partículas entranlas células por endocitosis, un proceso que está influenciada por el tamaño de las nanopartículas 21, el tipo de célula y el estado de diferenciación 22 y la capacidad celular para llevar a cabo phago- y macropinocitosis 23. La concentración óptima para obtener una señal de fluorescencia satisfactoria tiene que ser probado para cada aplicación individual o línea celular. Con ese fin, el primer experimento debe ser siempre la aplicación del control captación para evaluar la compatibilidad de las sondas dentro de los tipos de células y condiciones de cultivo antes de pasar a la detección específica de la diana de la expresión génica.
Un punto fundamental para obtener resultados fiables al aplicar este protocolo para una novela línea celular o población celular es la inclusión de controles adecuados. El control de la captación de fluorescencia nunca proporcionará un indicio que las concentraciones de nanopartículas inducirán una señal fluorescente suficiente en la población de células diana. La fluorescencia se debe evaluard al día siguiente ya que la señal se desvanecerá con el tiempo 17. Al mismo tiempo el control scramble sin una contraparte en el genoma eucariótico aplicado a una concentración idéntica debe inducir una señal de fondo despreciable. Como tercera de control, es aconsejable utilizar una nanopartícula específico para un gen de mantenimiento (por ejemplo, GAPDH, β-actina). Estas nanopartículas sirven como un control positivo que el enfoque se puede utilizar para detectar la expresión de genes específicos en la población celular diana seleccionada. Si estos controles resultan satisfactorias se puede esperar obtener señales fluorescentes específicas fiables utilizando nanopartículas específicas para otros genes diana. La concentración de las nanopartículas aplicadas también puede ser crítico, ya que se ha demostrado que regular a la baja la secuencia diana 24. Sin embargo, este efecto requiere concentraciones mucho más altas (5 nM) que las concentraciones utilizadas en los experimentos presentados aquí (400 pM). A esta concentración la nanoflares no afectan ARNm objetivo gen o los niveles de proteína y concentraciones de hasta 2 nM no perjudiquen la proliferación de las células HEK293 y células madre embrionarias murinas 17. Además, un análisis de la expresión del genoma completo no reveló cambios significativos en la expresión génica 25. Por lo tanto, en concentraciones de hasta 1 nM las nanoflares no deberían exhibir efectos adversos importantes.
Una aplicación muy prometedor de esta tecnología es la posibilidad de etiquetar cualquier población de células dada que está marcado por un gen específico. Recientemente, las nanopartículas de genes específicos de éxito han sido utilizados para teñir selectivamente miocitos ventriculares en vivo 26, subpoblaciones de células de melanoma 27, monocitos y células cerebelosa 28 culturas 29. Tales poblaciones de células de fluorescencia de marcado pueden ser ordenados y se purificaron por citometría de flujo como células vivas. En el campo de la oncología es imaginable para aislar las células tumorales metastásicas en vivo en modelos animalesen base a su expresión de CEA, más valioso para la búsqueda de metástasis potencial de promoción de genes o estructuras diana. Recientemente hemos demostrado que las colonias iPS murinas verdaderamente reprogramadas pueden ser identificados in situ con Nanog específicos de nanopartículas basadas en la intensidad de fluorescencia detectada 17. Por lo tanto, la identificación de las colonias de iPS reprogramadas verdaderamente se podría realizar en las plataformas de alto rendimiento, que utilizan la detección de fluorescencia robótica y los dispositivos de picking para identificar las colonias más prometedores. Esta tecnología parece ser adecuada en muchas áreas de investigación para seleccionar subpoblaciones celulares específicos y parece posible aplicar las nanopartículas en plataformas de alto rendimiento. En conclusión, este protocolo representa un nuevo enfoque marcado con fluorescencia usando nanopartículas que permite la detección de la expresión génica intracelular directamente en células vivas. Esta tecnología puede ser una herramienta valiosa para purificar, ampliar y más carácterize subpoblaciones celulares raras en muchas áreas de investigación.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |