Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
Xenopus laevis estratto uovo è uno strumento potente e ampiamente applicato per studiare eventi cellulari complicati nella semplicità di un test cell-free. Fin dalla loro prima descrizione da Lohka & Masui 1 che sono stati ampiamente utilizzati per studiare i processi mitotici quali la condensazione della cromatina 2, del fuso 3, rottura membrana nucleare 4, ma anche il trasporto nucleocytoplasmic 5 o 6 replicazione del DNA. Gli eventi che si svolgono al termine della mitosi, necessari per la riforma del nucleo interfasico quali riforma membrana nucleare e poro nucleare complesso rimontaggio sono molto meno inteso rispetto ai primi eventi mitotico ma possono essere studiati in modo simile utilizzando Xenopus estratto uovo 7. Abbiamo recentemente stabilito un saggio basato su estratto uovo Xenopus per studiare cromatina decondensazione alla fine della mitosi 8, un processo sotto-indagato che attende its caratterizzazione dettagliata.
In metazoi, cromatina è altamente condensato all'entrata mitotica per eseguire fedelmente la segregazione del materiale genetico. Per garantire che la cromatina è accessibile per l'espressione genica e la replicazione del DNA durante interfase, deve essere de-compattato alla fine della mitosi. Nei vertebrati, cromatina è fino a cinquanta volte più compatta durante la mitosi rispetto interfase 9, in contrasto con lieviti dove la compattazione mitotico è generalmente molto inferiore, ad esempio, solo due volte nella S. cerevisiae 10. Vertebrato cromatina decondensazione è stata per lo più studiata nel contesto della riorganizzazione del DNA spermatico dopo la fecondazione delle uova. Un meccanismo molecolare, in cui nucleoplasmin, una proteina ovocita abbondante, scambia protamine specifici sperma di istoni H2A e H2B memorizzati nel uovo. Questo processo è stato anche chiarito utilizzando Xenopus estratto uovo 11, 12. Tuttavia, l'espressionedi nucleoplasmin è limitata a ovociti 13 e cromatina mitotico non contiene queste protamine specifici sperma. Pertanto cromatina decondensazione alla fine della mitosi è nucleoplasmin indipendente 8.
Per la reazione decondensazione in vitro impieghiamo estratto generato da attivi X. laevis uova e cluster cromatina isolate da cellule HeLa sincronizzate. Il trattamento di uova con un ionoforo del calcio imita il rilascio del calcio nel citoplasma dell'ovocita generato da ingresso dello spermatozoo durante la fecondazione. L'onda di calcio innesca la ripresa del ciclo cellulare e l'uovo, arrestato nella seconda metafase della meiosi, progredisce alla prima interfase 14. Pertanto, gli estratti di uova preparati forma attivata uova rappresentano lo stato uscita / interfase mitosi e sono competenti per indurre eventi specifici per l'uscita mitosi come cromatina decondensazione, membrana nucleare e poro riforma complessa. Per l'isolamento di ch mitoticaromatin cluster abbiamo usato una versione leggermente modificata del protocollo pubblicato da Gasser & Laemmli 15, dove i cluster cromosomiche sono rilasciate dai lisi da cellule HeLa sincronizzate in mitosi e isolati in poliammine contenenti buffer da centrifugazioni gradiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis estratti a base di uova sono uno strumento molto utile per riprodurre fedelmente i processi cellulari in vitro, e questo sistema è stato utilizzato con successo nella caratterizzazione degli eventi del ciclo cellulare e la divisione cellulare 2, 3,5,6,17. A causa di grandi negozi di componenti nucleari sequestrati nell'uovo durante oogenesi, estratti a base di uova sono una fonte eccellente di componenti cellulari. Rispetto ad altri approcci come RNAi su linee …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca e l'ERC (AN377 / 3-2 e 309.528 CHROMDECON a WA) e un PhD Fellowship della Boehringer Ingelheim Fonds a AKS Figura 1 e 2 sono ristampati da Developmental Cell 31 (3), Magalska , RuvB-come la funzione ATPasi nella cromatina decondensazione alla fine della mitosi, 305-318, 2014 et al., gentile concessione di Elsevier.
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
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