Сотовый бесплатно Анализ по изучению хроматина деконденсацию в конце митоза
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
Xenopus Laevis яйцо экстракт является мощным и широко прикладной инструмент для изучения сложных клеточных событий в простоте бесклеточной анализа. Так их первого описания по Lohka & Мазуи 1 они были широко используется для изучения митоза процессы, такие как конденсации хроматина 2, сборки веретена 3, пробоя ядерной оболочки 4, но и цитоплазматический транспорт 5 или 6 репликации ДНК. События, происходящие в конце митоза, необходимые для реформирования межфазной ядра, такие как реформирования ядерной оболочки и ядерных пор сложной сборки значительно менее понятны по сравнению с началом митоза событий, но аналогично могут быть изучены с помощью Xenopus яичный экстракт 7. Недавно мы установили анализа, основанного на Xenopus яичного экстракта для изучения хроматина деконденсацию в конце митоза 8, процесс под исследовали, что ожидает ят.с. подробную характеристику.
В многоклеточных, хроматин конденсируется при высокой митотической вступления в целях выполнения точно, в сегрегации генетического материала. Чтобы гарантировать, что хроматин доступна экспрессии генов и репликации ДНК во время интерфазы, он должен быть де-уплотненный на конце митоза. У позвоночных, хроматин до пятидесяти раз больше уплотняется во время митоза по сравнению с интерфазе 9, в отличие от дрожжей, где митотический уплотнения, как правило, значительно ниже, например, только в два раза в S. Cerevisiae 10. Позвоночных хроматина деконденсация была в основном изучена в контексте реорганизации ДНК спермы после оплодотворения яйцеклетки. Молекулярный механизм, в котором нуклеоплазмина, обильное белок яйцеклетки, сперма обмен конкретных протамины в гистонов H2B H2A и хранящиеся в яйце. Этот процесс был также выяснены при помощи Xenopus экстракт яичного 11, 12. Однако выражениеиз нуклеоплазмина ограничен ооцитов 13 и митотического хроматина не содержит этих спермы конкретных протамины. Поэтому хроматина деконденсацию в конце митоза нуклеоплазмина независимая 8.
Для реакции в пробирке деконденсацию мы используем экстракт сгенерированный из активированных X. Laevis яиц и хроматина кластеров, выделенных из клеток HeLa синхронизированных. Лечение яиц с ионофора кальция имитирует высвобождение кальция в яйцеклетки, порожденной вступления сперматозоидов в процессе оплодотворения. Волна кальция вызывает возобновление клеточного цикла и яйцо, арестованного во второй метафазе мейоза, прогрессирует до первого интерфазы 14. Таким образом, яйцо экстракты, приготовленные формы активируется яйца представляют митотическую состояние выхода / интерфазной и компетентны, чтобы вызвать события, специфические для выхода из митоза как хроматина деконденсации, ядерной оболочки и корпеть комплексного реформирования. Для выделения митотического чromatin кластеров мы использовали слегка модифицированную версию протокола, опубликованного Гассер и Laemmli 15, где кластеры хромосом выпущен лизис клеток HeLa с синхронизированными в митозе и изолированных в полиаминными содержащий буферов градиентные центрифугирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus Laevis яйцо экстракты являются очень полезным инструментом для точного воспроизведения клеточные процессы в пробирке, и эта система была успешно использована в характеристике клеточного цикла и деления клеток событий 2, 3,5,6,17. В связи с большими запасами ядерных…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Немецкого исследовательского фонда и ERC (AN377 / 3-2 и 309528 CHROMDECON в Вашингтон) и PhD Братство Берингер Ингельхайм Fonds к АКС Рисунок 1 & 2 перепечатаны с Developmental Cell 31 (3), Magalska и др., RuvB, как функция АТФазы хроматина деконденсации в конце митоза, 305-318, 2014, с любезного разрешения Elsevier.
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
- Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
- Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
- Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
- Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
- Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
- Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
- Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
- Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
- Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
- Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
- Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
- Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
- Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
- Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
- Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).
