A Cell Assay libre d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
Xenopus laevis extrait d'oeuf est un outil puissant et largement appliquée pour étudier les événements cellulaires complexes dans la simplicité d'un essai acellulaire. Depuis leur première description par une Lohka & Masui ils ont été largement utilisés pour étudier les processus mitotiques telles que la condensation de la chromatine 2, l'assemblage de broche 3, l'enveloppe nucléaire ventilation 4, mais également transport nucléocytoplasmique 5 ou 6 replication de l'ADN. Les événements qui se déroulent à la fin de la mitose, nécessaires pour la réforme du noyau interphasique tels que la réforme de l'enveloppe nucléaire et pore nucléaire remontage complexes sont beaucoup moins bien compris par rapport aux événements mitotiques précoces, mais peuvent être étudiées de manière similaire en utilisant Xenopus extrait d'oeufs 7. Nous avons récemment mis en place un essai basé sur Xenopus extrait d'oeufs d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose 8, un processus de sous-enquête qui attend its caractérisation détaillée.
Chez les métazoaires, la chromatine est fortement condensé à l'entrée en mitose, afin de remplir fidèlement la ségrégation du matériel génétique. Pour garantir que la chromatine est accessible pour l'expression des gènes et la replication de l'ADN pendant l'interphase, il doit être dé-compacté à la fin de la mitose. Chez les vertébrés, la chromatine est jusqu'à cinquante-pli plus compacté lors de la mitose par rapport à l'interphase 9, contrairement aux levures mitotique où le compactage est généralement beaucoup plus faible, par exemple, seulement deux fois dans S. 10 cerevisiae. Animal vertébré décondensation de la chromatine a été principalement étudié dans le cadre de la réorganisation de l'ADN de sperme après fécondation des oeufs. Un mécanisme moléculaire, dans laquelle nucléoplasmine, une protéine de l'ovocyte abondante, échange protamines spécifique sperme à histones H2A et H2B stockées dans l'œuf. Ce processus a également été élucidée en utilisant Xenopus extrait d'oeufs 11, 12. Toutefois, l'expressionde nucléoplasmine est limitée à 13 ovocytes et la chromatine mitotique ne contient pas ces protamines spécifique sperme. Par conséquent, la décondensation de la chromatine à la fin de la mitose est indépendant nucléoplasmine 8.
Pour la réaction de décondensation in vitro, nous employons extrait généré à partir activés X. laevis œufs et des grappes de chromatine isolés à partir de cellules HeLa synchronisés. Traitement des œufs avec un ionophore de calcium imite la libération de calcium dans l'ovocyte généré par l'entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation. La vague de calcium déclenche la reprise du cycle cellulaire et de l'œuf, arrêté dans la deuxième métaphase de la méiose, progresse à la première interphase 14. Par conséquent, les extraits d'œufs préparés forme activée oeufs représentent l'état de sortie / interphase mitotique et sont compétents pour induire des événements spécifiques pour la sortie mitotique comme décondensation de chromatine, enveloppe nucléaire et pores réforme complexe. Pour l'isolement de ch mitotiqueromatin grappes, nous avons utilisé une version légèrement modifiée du protocole publié par Laemmli Gasser et 15, où les grappes de chromosomes sont libérés par lyse de cellules HeLa en mitose synchronisés et isolés dans des tampons contenant des polyamines par centrifugations à gradient.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis extraits d'œufs sont un outil très utile pour reproduire fidèlement les processus cellulaires in vitro, et ce système a été utilisé avec succès dans la caractérisation des événements du cycle cellulaire et la division cellulaire 2, 3,5,6,17. En raison de grands magasins de composants nucléaires séquestrés dans l'œuf cours de l'ovogenèse, extraits d'œufs sont une excellente source de composants cellulaires. Comparé à d'autres ap…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche et l'ERC (AN377 / 3-2 et 309528 CHROMDECON à WA) et d'un doctorat de la Bourse Boehringer Ingelheim Fonds AKS Figure 1 & 2 sont reproduites à partir de Developmental Cell 31 (3), Magalska et, la fonction des ATPases RuvB-comme dans décondensation de chromatine à la fin de la mitose, 305-318 2014 al., avec l'aimable autorisation de Elsevier.
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
- Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
- Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
- Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
- Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
- Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
- Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
- Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
- Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
- Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
- Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
- Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
- Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
- Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
- Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
- Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).
