الخلايا الجذعية مثل<em> القيطم</em> الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em> في المختبر</em> و<em> في فيفو</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
يظهر الجهاز العصبي الفقاريات من لوحة العصبية باعتبارها طبقة متجانسة من الخلايا الظهارية العصبية. فهم كيفية يسببها البرامج التنموية، ترميز، وأنشأ خلال الجهوية لوحة العصبية هو، في الوقت الحاضر، وهو هدف رئيسي في البيولوجيا التطورية. مقارنة مع النظم الأخرى، والقيطم الجنين قابلة تجريبيا هو نموذج للاختيار لتحليل الخطوات الأولى من 1،2 تطوير العصبي. فمن السهل الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة، والتنمية الخارجية يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى لتكون العصيبة 3. تتوفر للتلاعب تجريبيا القيطم المورق (X. المورق) التطور الجنيني العديد من الأدوات. الدقيقة حقن من mRNAs أو morpholinos (MO)، بما في ذلك المنظمات الأعضاء محرض، جنبا إلى جنب مع أدوات البيوكيميائية والدوائية، يسمح السيطرة على زيادة وظيفة (GOF) وفقدان وظيفة (LOF) والتعديل المحدد من مسارات إشارات 4،5. جيش تحرير بلوشستانstocoel سقف الأديم الظاهر، وتقع حول القطب الحيواني من الأريمة أو المعيدة الجنين في وقت مبكر جدا، ويشار إليها باسم "كاب الحيوان" (AC)، هو مصدر الخلايا المحفزة التي يمكن برمجتها من خلال التلاعب في التعبير الجيني قبل إإكسبلنتس الإعداد. في هذه المخطوطة هي بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لاستخدام X. إإكسبلنتس المورق AC لاختبار في المختبر والآليات الجزيئية الجسم الحي والعمليات الخلوية تطوير العصبية الكامنة.
ويرد تقنية، مما يتيح مراقبة دقيقة من أنماط التعبير الجيني في القيطم أنبوب الشرغوف العصبية، وهي خطوة أولية في تحديد العظة تقرير المصير. في حين أن مراقبة الأنسجة مسطحة شنت يشيع استخدامها في دراسة افراخ الدجاج 6، أنه لم يتم وصفها بشكل صحيح في القيطم. التلاعب في التعبير الجيني عن طريق حقن مرنا الاصطناعية أو MO في عن Blastomeres من 2 أو 4 أجنة مرحلة الخلية يسمح برمجة ACإإكسبلنتس 4. على سبيل المثال تثبيط مخلق العظام البروتين (BMP) مسار كتبها التعبير عن مكافحة BMP عامل رأس، ويعطي هوية العصبية إلى الخلايا AC 3. هو مفصل بروتوكول لأداء التعرض المحلي والتي تسيطر عليها وقت إإكسبلنتس AC لاشارات خارجية عن طريق الاتصال المباشر مع حبة راتنج تبادل أنيون. أخيرا يوصف تقنية لاختبار الميزات التنموية من الأسلاف العصبية في الجسم الحي بواسطة زرع إإكسبلنتس مختلطة أعد من خلايا متميزة مبرمجة فصلها وإعادة المصاحب.
جنين الضفدع هو نموذج قوي لدراسة مبكرة التطور العصبي الفقاريات. الجمع بين التلاعب في التعبير الجيني ليزدرع الثقافات في المختبر يوفر معلومات هامة في دراسة الجهوية الظهارة العصبية، والانتشار، والتشكل 7-12. برمجة إإكسبلنتس AC سمحت وضع القلب وظيفية خارج الجسم الحي 13،14. الاستخداممن يزدرع تطعيم 15 أدت إلى التعرف على مفتاح النسخي الحد الأدنى من حمل البرنامج التمايز قمة العصبية 16. وintrathalamica المحدد للزونا (ZLI) هو مركز الإشارات التي تفرز القنفذ سونيك (Shh على) للسيطرة على النمو والإقليمي على الدماغ الأمامي الذيلية. عندما تتعرض باستمرار لShh على الخلايا الظهارية العصبية coexpressing عامل الجينات الثلاثة النسخ – باره مثل homeobox 2 (barhl2)، orthodenticle 2 (otx2) والايروكوا-3 (irx3) – الحصول على اثنين من خصائص المقصورة ZLI: اختصاص ل التعبير عن SHH، والقدرة على فصل من الخلايا العصبية لوحة الأمامية. كنظام نموذج، وستعرض تحريض على مصير ZLI إلى خلايا عصبية ظهارية 8.
وتهدف هذه البروتوكولات في توفير بسيطة ورخيصة، وأدوات فعالة لعلماء البيولوجيا التطورية وغيرهم من الباحثين على استكشاف وزارة التعليم الأساسيhanisms للسلوكيات الأساسية الخلية العصبية. هذه البروتوكولات هي متعددة للغاية وتسمح بالتحقيق في طائفة واسعة من الاشارات العصبية تقرير خارجي والجوهرية. ويسمح على المدى الطويل في التحليل المجراة على التزام النسب العصبية والتفاعلات الاستقرائي والسلوكيات الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومدبرة التطور العصبي بواسطة تفاعل معقد بين البرامج التنموية الخلوية وإشارات من الأنسجة المحيطة بها (مراجعة في 3،31،32). نحن هنا وصف مجموعة من البروتوكولات التي يمكن استخدامها في X. المورق الأجنة لاستكشاف خارجي والعوامل الجوهرية التي ينطوي عليها العصبي تقرير…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. . Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?. Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
