Stem Cell-like<em> Xenopus</em> Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em

Summary

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Abstract

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Introduction

O sistema nervoso de vertebrados emerge da placa neural como uma camada homogénea de células neuroepiteliais. Compreender como os programas de desenvolvimento são induzidas, codificado e estabelecido durante regionalização da placa neural é, actualmente, um dos principais objetivos em biologia do desenvolvimento. Em comparação com outros sistemas, o embrião Xenopus experimentalmente receptivo é um modelo de escolha para analisar etapas iniciais de ^1,2 desenvolvimento neural. É fácil de obter um grande número de embriões, e desenvolvimento externo dá acesso aos primeiros passos de neurulação ^3. Muitas ferramentas estão disponíveis para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) o desenvolvimento embrionário. A micro-injecção de ARNm ou morpholinos (MO), incluindo OMs indutíveis, em conjunto com as ferramentas bioquímicas e farmacológicas, permite que o ganho de função (GOF) e perda de função (LOF) e alteração específica de vias de sinalização ^4,5 controlada. O blastocoel ectoderme telhado, localizada em torno do pólo do animal de uma blástula, ou um gástrula embrião precoce, e referido como o "tampão animal '(AC), é uma fonte de células pluripotentes, que pode ser programado por manipulação da expressão do gene antes da explantes preparação. Neste manuscrito são protocolos detalhados para usar X. explantes laevis AC para testar in vitro e in vivo em mecanismos moleculares e processos celulares desenvolvimento neural subjacente.

Uma técnica é apresentada, que permite a observação fina de padrões de expressão de genes em um tubo de girino Xenopus neural, um passo preliminar na identificação de sinais de determinação de destino. Considerando que a observação dos tecidos lisos-montado é comumente utilizada no estudo de embriões de galinha ^6, que não foi correctamente descrita em Xenopus. Manipulação da expressão do gene através da injeção de mRNA sintético ou MO para os blastômeros de 2 ou 4 embriões em estágio de célula permite a programação de ACexplantes ^4. Por exemplo inibição da proteína morfogenética óssea (BMP) via pela expressão do anti-BMP fator Noggin, dá uma identidade neural de células Cl ^3. O protocolo é detalhado para a realização de exposição local e controlada no tempo de explantes AC aos sinais extrínsecos através de contacto directo com uma esfera de resina de permuta aniónica. Finalmente uma técnica está descrito para testes do desenvolvimento dos progenitores neurais in vivo por transplantação de explantes preparados a partir de células mistas distintas programado dissociados e re-associadas.

O embrião rã é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento neural vertebrado cedo. Combinando a manipulação da expressão génica explantar culturas in vitro fornece informações importantes no estudo do neuroepitélio regionalização, proliferação, e morfogénese ^7-12. A programação de explantes AC permitido o desenvolvimento de um coração funcional ex vivo ^13,14. O usoexplante de enxerto ¹⁵ levou à identificação do comutador de transcrição mínima induzir o programa de diferenciação crista neural ^16. O intrathalamica limitans Zona (ZLI) é um centro de sinalização que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar o crescimento e regionalização da parte frontal do cérebro caudal. Quando continuamente exposto a Shh, as células gliais coexpress� os genes do factor de três de transcrição – barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) e iroquois-3 (irx3) – adquirir duas características do compartimento de ZLI: a competência para expressar shh, ea capacidade de segregar a partir de células placa neural anterior. Como um sistema modelo, a indução de um destino ZLI em células neuroepiteliais será apresentado ^8.

Estes protocolos visam fornecer e ferramentas eficientes simples e baratos para os biólogos do desenvolvimento e outros pesquisadores a explorar o mec fundamentaishanisms de comportamentos de células neurais chave. Estes protocolos são muito versáteis e permitem a investigação de uma vasta gama de sinais neurais de determinação extrínsecos e intrínsecos. Ele permite a longo prazo na análise in vivo de compromisso linhagem neural, interações indutivas e comportamentos celulares.

Protocol

Experimentos cumpram a regulamentação nacional e comunitária relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos e com os princípios internacionalmente consagrados de substituição, redução e aperfeiçoamento. 1. Plano-montagem de Xenopus laevis girinos Tubo Neural Anterior Depois de Todo-mount Hibridização In Situ Obter X. laevis embriões de acordo com os procedimentos padrão 4 e idade eles até que atinjam neurul…

Representative Results

Com base em considerações morfológicas em espécies diferentes, manipulações embriológicos, e o padrão de expressão de genes reguladores, um modelo conceptual que prende a placa neural é dividida em segmentos longitudinais e transversais que definem uma grade de desenvolvimento gerar campos histogênica distintas. Na placa neural, o primórdio do cérebro anterior, mesencéfalo, rombencéfalo e medula espinal são já estabelecida ao longo do eixo ântero-posterior (AP), durante…

Discussion

Desenvolvimento neural é orquestrado por uma complexa interação entre os programas de desenvolvimento celulares e sinais dos tecidos circundantes (revisto em ^3,31,32). Descrevemos aqui um conjunto de protocolos que podem ser utilizados em X. laevis embriões para explorar extrínsecos e intrínsecos factores envolvidos na determinação do destino neural e morfogénese neuronal in vitro e in vivo. Estes protocolos podem ser utilizados como tal em X. embriões <e…

Materials

Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation