Bioluminesens-Based Tumor Kvantifisering Metode for Monitoring tumorprogresjon og behandlingseffekter i muslymfom Modeller

Summary

Bioluminesens bildebehandling er et velkjent verktøy for lokalisering av svulster og metastaser, men kvantifisering av disse bildene krever ofte komplekse beregninger og spesielle instrumenter. Vi beskriver lett-å-bruke luminoscore metode, basert på presise oppkjøps forhold, krever ingen beregninger, og muliggjør tumorbelastning og behandlingsrespons som skal overvåkes i musemodeller.

Introduction

Tidlig svulst celle påvisning er fortsatt en utfordring og er avgjørende for å øke kreftbehandling effekt. In vivo bioluminesens imaging (BLI) er en svært følsom, ikke-invasiv optisk teknikk, mye brukt for å overvåke svulster i små dyr. Ildflueluciferase-uttrykkende celler blir ofte brukt for slike eksperimenter ^1,2. Dette oxygenase oksiderer D-luciferin med molekylært oksygen, men krever to kofaktorer - Mg ²⁺ og adenosin trifosfat ^tre. Ildflue luciferase er mer egnet for in vivo avbildning enn Renilla luciferase ⁴ fordi dens kvanteutbytte er høyere.

Den oksidert underlaget - oxyluciferin - spontant avgir et foton å gå tilbake til sin grunnleggende tilstand og deretter blir inaktiv. De utsendte fotoner ha en maksimal bølgelengde rundt 530 nm. En høy følsomhet kamera kan detektere den luminescerende fotonene fra innsiden av et lite dyr, og gi bilder som gjør det Muligible for å lokalisere tumorceller.

Muligheten til å kvantifisere tumorbyrde nøyaktig ved fotontelling kan tjene som en kraftig og følsomt verktøy for kvantifisering av behandlingseffekten. Fordi behandlingseffekter kan detekteres før, kan denne følsomhet gjør det mulig å bestemme det nøyaktige øyeblikk hvor en behandling blir effektiv.

Absolutt mengdebestemmelse av det totale utsendte fotoner er meget kompleks. Antallet av fotoner som er samlet avhenger av dybden av tumoren og på organer fotonene slippes gjennom. Korreksjonskoeffisienter basert på vev absorpsjonskoeffisienter kan beregnes ^5, men den absolutte kvantifisering av tumorcelleantall krever kjenne antallet av fotoner som sendes ut av hver tumor celle. Videre er luciferase uttrykk, som det av flere rapportørgener (f.eks., Fluorescerende proteiner) ikke homogent, til og med i en cellepopulasjon avledet fra en enkelt klon ^6. Antallet luciferASE proteiner i celler kan ikke beregnes nøyaktig. Etableringen av standardiserte forsøksbetingelser vises derfor avgjørende for en pålitelig semi-kvantitativ analyse.

Vi benyttet den luminoscore metoden til to forskjellige muslymfomceller modeller ^7,8,9. I disse modellene er syngeniske tumorceller injisert i øyet eller under huden for å oppnå henholdsvis en primær intraokulær lymfom (Piol) modell og en subkutan lymfom (SCL) modell. I hver av disse modellene ortotopiske, blir behandlingen administreres in situ, syv dager etter svulst inokulering for Piol og når tumoren har nådd 0,5 til 0,7 cm i dets største diameter for SCL.

Vi brukte luminoscore metode for å overvåke effekten av in situ CpG terapi, tidligere vist å være effektive ^7,10,11. CpG er en oligonukleotid-sekvens og en ligand av TLR9, som i sin tur er en intracellulær reseptor uttrykt ved tallrike cells av immunsystemet, inkludert dendrittiske celler, B-lymfocytter, monocytter og naturlige dreperceller. CpG-DNA er en 20-mer DNA-sekvens som inneholder CpG (CG) immunstimulerende motiv; kontrollen (ODN-kontroll), er den samme 20-mer-DNA-sekvensen, bortsett fra at det immunstimulerende CG sekvensen er invertert (GC). TLR9 engasjement i murine lymfom vi studerer induserer apoptose ^10, aktiverer immunsystemet ^12, og dermed reduserer tumorbelastning ^7,11 betydelig.

Her beskriver vi en standardisert metode for å kvantifisere tumorbelastning og behandlingsrespons gjennom selvlysende bilder. Denne metoden er avhengig av ulike aspekter av bilde prosedyren, fra anskaffelse til analyse, for å optimalisere pålitelighet, reproduserbarhet, non-user avhengighet, og statistisk signifikans. En bioluminesens kvantifisering indeksen er knyttet til hver mus; denne verdien, som vi kaller en luminoscore, kan sammenlignes ikke bare mellom dyr, men alså mellom eksperimenter.

I dette arbeidet har vi fokus på bioluminescence bildebehandling prosedyre samt bilde kvantifisering av luminoscore metoden. Vi viser effektiviteten av denne fremgangsmåte for å verifisere injeksjon, overvåking tumorbyrde, og vurdering av effektiviteten av in situ behandling av kreft. Hvert av disse punktene er illustrert i representative resultater fra forsøk med ulike musemodeller for å markere tilpasningsevne av luminoscore metoden.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer mus oppfylt EUs retningslinjer, franske regler for dyreforsøk (Landbruksdepartementet lov nr 2001-464, mai 2001) og retningslinjene fra Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM) komité Animal Research, og ble godkjent av relevante lokale komiteen (Charles Darwin etiske komité for dyreforsøk Paris, Frankrike, Permit Number: p3 / 2009/004).

1. Cell Forberedelse

1. Vokse mus B lymfom-cellelinje A20.IIA-luc2 i RPMI-1640 Glutamax medium supplementert med 10% føtalt kalveserum, 100 ug / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM natriumpyruvat, 50 mM 2-merkaptoetanol og 0,50 mg / ml hygromycin B.
2. Opprettholde cellekultur ved 37 ° C, _5% CO2 og endre medium hver to til tre dager. Harvest-5 ml av cellesuspensjonen med en pipette en dag etter endring av medium.
3. Spin celler ved 3005; g i 10 minutter og suspendere cellene i 3 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Gjenta dette trinnet to ganger for å vaske cellene.
4. Bland 15 ul cellesuspensjon med 30 mikroliter trypanblått merking før du legger en Malassez tellekammer. Beregn cellekonsentrasjon med formelen: Konsentrasjon (celler / ml) = antall celler i tellegitteret * 3 * 1000.
5. Spinn cellene én gang til ved 300 xg i 10 min. Fjern supernatanten med en pipette. Med C er konsentrasjonen beregnet ved trinn 1.4), er det antall celler N = C * 3.
6. Beregn volum sterilt PBS 1x nødvendig for å oppnå en cellesuspensjon i en konsentrasjon på 5 x 10 ⁷ celler / ml med den følgende formel: PBS Volum (ml) = N / (5 x 10 ^7). Suspen cellepelleten (fra trinn 1.5)) i volumet av steril PBS 1x beregnet i foregående setning. Cellesuspensjonen A er som skal brukes i den SCL-modellen (in vivo injiserte volum er 100 ul: 5 x 10 ⁶ cells).
7. Pipetter 10 ul av cellesuspensjonen A og tilsett 90 ul steril PBS i et 1,5 ml rør for å oppnå 100 ul av cellesuspensjonen B ved 5 x 10 ⁶ celler pr ml. Cellesuspensjonen B er som skal brukes i den Piol modellen (in vivo injiserte volum er 2 ul: 1 x 10 ⁴ celler).

2. Luciferin

1. Fortynn 1 g av D-luciferin kaliumsalt pulver i 30 ml steril PBS 1x i et 50 ml rør og rist i noen få sekunder for å oppløse aggregatene.
   MERK: Fordi luciferin er følsom for lys, forberede 500 ul porsjoner i mørke 1,5 ml mikrosentrifugerør.
2. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
   MERK: delmengder kan lagres i flere måneder.
   Etter tining må alikvotene ikke lagres i mer enn en dag ved + 4 ° C. Frysing-tine sykluser er å foretrekke for lagring ved 4 ° C.
3. Injisere 100 mL av D-luciferin potassium salt løsning intraperitonealt for hver bilde assay.
   Merk Denne oppløsning tilsvarer 3,3 mg per mus i en dose på 150 mg / kg.

3. bedøvelsesmidler og anesthetization

1. Fremstille et anestetikum oppløsning ved blanding av ketamin 120 mg / kg xylazin og 6 mg / kg i sterilt PBS 1x.
2. Injiser 60 mL av anestesiblanding intraperitonealt for hver avbildning analysen med en 25 G nål. For operasjon (med Piol eller SCL modell), injisere 80 pl av blandingen for å oppnå en dypere bedøvelse. Plasser muse tilbake i buret sitt.
3. Når musen vises immobile, tatt den ut av buret og forsiktig klem musens etappe mellom fingrene. Hvis musen reagerer med en flukt refleks, vente flere minutter. Gjenta handlingen til musen ikke reagerer, som bekrefter tilfredsstillende anesthetization.
4. Plasser musen på en varmeplate eller under en varmende lys.
5. Påfør øye salve for å unngå øye tørrhet under bedøvelsen for bildeanalyse eller for SCL kirurgi. påførøyesalve etter operasjonen for Piol modell.

4. kirurgi og Cell Inoculation

MERK: Utfør alle kirurgiske prosedyrer på en varmeplate eller under en varmende lys, i en type 1 mikrobiologisk sikkerhetskabinett i et dyr biosikkerhetsnivå 2 anlegg. Alle kirurgiske verktøy benyttet i denne delen ble autoklavert før bruk.

1. Subkutan lymfom Modell:
   1. Fremstille 100 ul av cellesuspensjonen oppnådd i trinn 1,6 i en 1 ml sprøyte med en 25 G nål. Klem forsiktig på musa huden på flanken mellom fingrene, på injeksjonsstedet. Sett nålen nøyaktig inn i hudfolden. For å sikre subkutan injeksjon, ikke plassere kanylen dypt inn i vevet.
      1. Sprøyt cellene inn i skinfold. Legg merke til om litt væske ball vises under huden for å bekrefte at injeksjonen er riktig utført.
2. Piol modell:
   MERK: Dette procedure krever 2 operatører, referert til her som operatør 1 og operatør 2.
   1. Fjerning av conjunctiva:
      1. Har Operatør en plass musen under et dissekere mikroskop. Trykk forsiktig med fingrene på hver side av øyet for å fjerne den. Hold denne posisjonen.
      2. Har Operator 2 l ook gjennom dissekere mikroskop. Grip conjunctiva med en liten tang i den ene hånden; med den annen side, kuttes conjunctiva like under tangen med en liten par kirurgiske sakser.
      3. Har Operatør en utgivelse øyet av musen trykket i trinn 4.2.1.1)
   2. Cell injeksjon:
      1. Forbered en 10-mL sløv presisjon sprøyte. Vask den ved å pumpe sterilt avionisert vann gjennom den. Gjenta to eller tre ganger for å sikre at det ikke er noen bobler i sprøyten. Deretter forberede 2 mL av cellesuspensjon til injeksjon.
      2. Har Operator 2 trykk forsiktig med fingrene på dene hånd på hver side av øyet for å fjerne den. Hold denne posisjonen.
      3. Har Operatør 1 grep kanten av øyet med en liten tang i den ene hånden og trekk den forsiktig bakover for å strekke vevet.
      4. Har Operator 2 l ook gjennom dissekere mikroskop. Med den andre hånden, lage et lite hull i den nedre øyeeplet av musen med en 32 G nål.
      5. Har Operator 2 sette ned p og plukk opp (med samme hånd) presisjonen sprøyten og stikk nålen inn i hullet gjort i trinn 4.2.2.4.
      6. Har Operatør en dytt på sprøytestemplet med den andre hånden.
      7. Operatøren har to v erify med dissekere mikroskop at cellesuspensjonen i sprøyten er fullstendig injisert inne i øyeeplet (væskestrømmen er lett observerbart).
      8. Har Operator 2 r EDra presisjon sprøyte.
      9. Har Operatør 1 r elease kanten av enimal øye grepet på trinn 4.2.2.3)
      10. Operatøren har to r elease sidene av øyet trykket i trinn 4.2.2.2)
      11. Påfør øye salve umiddelbart.
          MERK: Hvis alle trinn utført riktig, bør musen ikke blø i det hele tatt i løpet av denne prosedyren.

5. Bioluminesens Imaging - dag 0

MERK: Alle produkter injisert i mus må være ved romtemperatur før injeksjon. Etter svulst cellene har blitt vaksinert, og mens dyret fortsatt er bedøvet, fortsett til disse trinnene for bildebehandling.

1. Slå på imager og åpne oppkjøpet programvare. Initialiser kameraet, stadier, og linsene ved å klikke på "Initialize" -knappen. Initialisering vil ta 10 til 15 minutter for å være komplett.
2. Injisere 100 ul av D-luciferin kaliumsaltoppløsning intraperitonealt med en 25 G nål. Skal ikke gis det intravenøst. Hvis intravenous administrering er nødvendig for en eller annen grunn, må den D-luciferin natriumsalt benyttes i stedet for D-luciferin kaliumsalt.
   MERK: Luciferin er overflødig reaktant ved denne konsentrasjonen; derfor bioluminescence signal når et platå etter 3-7 minutter og vedvarer i mer enn 30 min.
3. 10 min etter D-luciferin injeksjon ^13, plasserer faget musen i imager. Plassere musen i sin naturlige stilling, ryggen mot kameraet, i så flat stilling som mulig. Denne stillingen er naturlig og lett reproduserbar.
4. Kryss av auto-eksponering funksjonen, og klikk på Acquire å erverve baksiden (posterior) bilde av dyret, med auto-eksponering funksjonen.
   MERK: Funksjonen for automatisk eksponering funksjonen optimaliserer eksponeringen tid ved å beregne det fra en 1-sek eksponering bilde. Dersom musens Bioluminescens signalet er negativt eller meget lav, kan det optimale eksponeringstiden bliautomatisk satt til mer enn 20 min. I dette tilfellet kan en eksponeringstid på 8 til 10 minutter være et godt kompromiss. Eksponeringstiden kan settes manuelt, men bildene skal ikke inneholde mettede piksler.
5. Snu musen for å eksponere foran musen til kameraet. Prøv å flate musen og spre sine fremre lemmer, slik at de ikke blokkerer brystet.
6. Erverve et frontbilde av dyret. Kontroller at autoeksponering boksen er fortsatt merket av, og klikk igjen på "Acquire" -knappen.
   MERK: Frontbildet kan bli kjøpt opp før ryggen bilde og vice versa. Den eksponeringstid på foran og bak bildene kan være forskjellig avhengig av den relative intensiteten til hver side av musen. Den beregnes automatisk når du bruker auto-eksponering funksjonen. Kvantifisering bruker bare foton fluks (fotoner per sekund), og er ikke avhengig av eksponeringstiden.
7. Plasser musen på en oppvarming plate eller under en varmende lys før det gjenoppretter fra narkosen og deretter plassere den tilbake i buret sitt.

6. Bioluminesens Imaging - Etter dag 0

1. Slå på imager, initialisere kameraet, stadier, og linsene som i trinn 5.1).
2. Bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av 60 ul av ketamin (120 mg / kg) / xylazin (6 mg / kg) blanding (se trinn 3.1 til 3.5).
   MERK: Denne metoden for anesthetization tillater avbildning hver 5 dager. For å utføre daglig avbildning, en metode som benytter isofluran som bedøvelsesmiddel og en bioluminescens imager egnet for bruk med denne anestesi er nødvendig.
3. Tilegne seg foran og bak bilder av dyr, ved hjelp av auto-eksponering funksjon, som i trinn 5.5) og 5.6). Håndter mus som i trinn 5.7).

7. Bioluminesens Kvantifisering og bildeanalyse

MERK: luminoscore Metoden er basert på bilde analyseverktøs. Når bildene er kjøpt i henhold til fremgangsmåten ovenfor, kan kvantifisering utføres når som helst (inkludert umiddelbart etter kjøpet), for å knytte en luminoscore til hver mus på hvert tidspunkt.

1. Vise "Tool Palette" ved å klikke på "View" -menyen og klikk på "Tool Palette" hvis det ikke allerede vises. Klikk på "ROI Tool" kategorien i verktøypaletten. Velg "Contour" -knappen og velg deretter "Free draw".
2. Manuelt markere det aktuelle området (ROI) rundt musa ved å følge kantene på musen på forfra. Lukk kontur med et høyreklikk på mus.
3. Klikk på "View" -menyen og deretter "ROI Målinger". Pass på at "Radiance (Fotoner)" er valgt i "måletyper" rulle menyen nederst til venstre på "ROI Målinger" -vinduet. Hvis ikke, velger du det. Deretter måle foton flux (ph / s) ved å registrere verdien i "Total Flux [p / s]" boksen.
   MERK: Ikke bruk Radiance eller annen enhet som er i forhold til avkastningen areal.
4. Gjenta trinn 7.2) og 7.3) for bakfra.
5. Sum de to foton flux verdier hentet fra foran og bak utsikt. Resultatet er luminoscore.
6. Sammenlign verdiene for hver gruppe ved hjelp av en passende statistikk test (ikke-parametrisk tosidig Mann-Whitney test, for eksempel) ^14.

Representative Results

Den Luminoscore metode kan tjene til Kontroller Tumor Cell Injection

I modeller som involverer injeksjon av et lite antall av tumorceller, eller ved injeksjonsstedet ikke tillater visuell kontroll av injeksjonen, kan det være meget vanskelig å sikre kvaliteten av injeksjonen. Den luminoscore metoden fungerer som en rask og praktisk verktøy for å kontrollere kvaliteten på prosedyren og konstatere enkelt og umiddelbart at alt gikk riktig. I begge modeller, er tumor påvises så tidlig som 10 minutter etter injeksjonen (figur 1A). Bildene alene være tilstrekkelig å verifisere at tumorceller er til stede i riktig sted. Ikke desto mindre, kvantifisere bildene som gir et inntrykk av heterogeniteten av injeksjonen. Den prikkplott (figur 1B) viser klart en forskjell mellom dyr som mottas (svarte prikker) og ikke retende oppta (rød linje) injeksjoner. Interessant, oppnådd i SCL modell signal er 100 ganger høyere enn i Piol modellen; Dette funnet er i samsvar med det antall celler injisert (5 x 10 ⁶ og 1 x 10 ⁴ celler, henholdsvis).

Figur 1. Verifikasjon av injeksjon i ulike muslymfom Models. De luminoscores målt 10 min etter tumorcelle inokulasjon i forskjellige Lymfekreft modeller. (A) Representative bilder av begge modellene. (B) Luminoscore av hvert dyr i de ulike modellene. Den røde linje tilsvarer den midlere bakgrunnsstøy målt på 10 dyr før tumorcelle inokulering; de stiplede linjene er gjennomsnitt +/- standardavvik. For hver modell, kan alle dyrene skal skilles fra bakgrunnsstøy. I Piol modellen, 1 x 10 ⁴ celler ble INOCulated i glasslegemet i høyre øye, og i SCL-modellen, 5 x 10 ⁶ celler subkutant inn i hver flanke av musen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Overvåking Tumor Burden og behandlingsrespons

Den luminoscore er også et kraftig verktøy for å studere tumorvekst og behandling effekt. Figur 2A viser representative bilder fra overvåkingen av tumorvekst i kontrollgruppen og den behandlede CpG Piol grupper. Musene ble inokulert med 1 x 10 ⁴ tumorceller hver, og behandling ble administrert in situ på dag 7. Bildene viser at etter en tilstrekkelig tid (28 dager), begynte metastaser skal vises i kontrollgruppen. Selv om den primære tumoren synes ikke følsom for behandling, færremetastaser ble observert i CpG-behandlede gruppe (tabell 1). Den kvantitative analyse av tumorbelastning i hver gruppe (figur 2B) viser at CpG bremset tumorutvikling, som produserer en statistisk signifikant forskjell mellom de behandlede og kontrollgruppen etter 28 dager (ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney-test p = 0,0079 ). Ikke desto mindre, svulstene fortsatt vokste i de behandlede mus, og ingen av dem overlevde (data ikke vist). Dette funnet er i samsvar med tidligere rapporter: CpG har ingen signifikant effekt på primær okulær svulster ^10. Den betydelige effekten som vi har her mellom ODN og CpG gruppen kommer fra metastaser veksthemming.

Figur 2. Overvåking Tumor Burden og behandlingsrespons. (A) Representative bilder av de to gruppene (ODN-kontroll og CpG-behandlet) of Piol-bærende mus. (B) Overvåking tumorbyrde med luminoscore. Som sett på dot plottet, er signifikant på dag 28. I disse to grupper virkningen av CpG på luminoscore denne metode har gjort det mulig å overvåke tumorbelastning og for å måle de små, men signifikante (p = 0,0079) effekter av CpG- DNA, som ikke kunne ha blitt oppdaget av bildene alene. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

grupper	Mus	Tilstedeværelse av metastaser	Lokasjon	Photon fluks (ph / s)
CpG	1	Nei	x	x
	2	Ja	9.32E + 05
	3	Nei	x	x
	4	Nei	x	x
	5	Ja	Eye-drenering lymp node	2.21E + 07
ODN	1	Ja	Eye-drenering lymp node	1.06E + 07
	2	Ja	Eye-drenering lymp node	7.25E + 07
	3	Ja	Eye-drenering lymp node + kontralateral	7.64E + 08
	4	Ja	Eye-drenering lymp node + kontralateral	1.74E + 09
	5	Ja	Eye-drenering lymp node + kontralateral	9.76E + 07

Tabell 1. Than Luminoscore metode kan tilpasses ulike tilnærminger

Den luminoscore Fremgangsmåten er ikke begrenset til en enkelt type musemodell. Figur 3 viser at den kan tilpasses til forskjellige musemodeller. I SCL-modellen, er to svulster podet på hver side av musen. Behandlingen administreres in situ til en enkelt side på dag 0, og den kontralaterale tumor tjener som dens kontroll (figur 3A). Derfor ble to ROI trukket per mus: en for hver side (Figur 3C). Forholdet mellom luminoscore på de behandlede og kontroll sider beskriver relative løpet av hver tumor. Dette forhold ble satt til en på dag 0, når behandlingen ble administrert. Vi har observert en betydelig reduksjon i denne forholdet 13 dager etter behandling administrering (figur 3D, ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney-test p = 0,004). Denne reduksjonen viser at den behandlede side-tumorer blitt resorbert, slik som vist i de representative Bioluminescens bilder (figur 3B).

Figur 3. Tilpasning av Luminoscore Metode til en modell med to primærtumor nettsteder. (A) Eksperimentell design av en SCL assay. Musene ble injisert med to primære svulster i hver flanke. Ene side er injisert med enten CpG-ODN eller DNA-kontroll, og den andre siden med PBS, for å tjene som kontroll. (B) Representative bilder av CpG-behandlede og kontrollmusene ved dag 0 og dag 13. Behandlingen ble administrert på dag 0. tumor~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP ble hemmet på CpG-behandlede side av musen. (C) den manuelt kodet regioner av interesse per dyr i to primærtumorsteder. (D) forholdet mellom luminoscores av CPG-behandlede eller ODN-kontroll siden og PBS kontrollsiden er en indeks somviser den relative vekst av hver tumor i det samme dyr. Dette forholdet ble satt til 1 på dag 0. På dag 13, hadde forholdet mellom CpG-behandlede gruppen sank signifikant (p = 0,004), avslører hemming av tumorvekst ved in situ administrering av CpG-DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Lys absorpsjon av organer og vev er fortsatt en begrensning av bioluminesens imaging, selv om denne begrensningen er iboende i ethvert optisk avbildningsfunksjonalitet. I sammenheng med vår tilnærming, blir virkningene av anatomiske strukturer på luminoscore forventet å ha lav variasjon forutsatt at undersøkelsene er utført i en gitt modell (plassering og mus streng), slik at deretter sammenligninger. Bioluminesens trenger ikke eksitasjonslys og således er mer tilpasset til hele kroppen in vivo avbildning enn fluorescens.

Romlig oppløsning er også en begrensning av bioluminesens imaging, og nøyaktig plassering av orgelet som Bioluminescens fotoner sendes ut er fortsatt vanskelig. Imidlertid kan gode kunnskaper om modellen hjelpe i den kvalitative plassering av tumorsteder. Den eneste utgang i dette bioluminescence baserte metoden er den luminoscore. Plassering påvirker ikke luminoscore fordi den manuelle påslag Region of interest (ROI) dekker hele musen. Til slutt krever ildflue luciferase oksygen. Følgelig bioluminesens bildeundervurderer vanligvis nekrotiske svulster. Igjen, er en god kjennskap til dette aspektet av den modell som kreves.

I denne artikkelen, er vi ikke sikte på å vurdere effekten av CpG som et anti-tumor medikament (som allerede har blitt demonstrert ^7,9,11), men for å beskrive en fremgangsmåte som tillater sammenligning av Bioluminescens datasett. Vi faktisk beskriver en metode for å kvantifisere tumorbyrden skal bidra til å standardisere oppkjøpet protokollen for å sammenligne ulike analyser på forskjellige steder til forskjellige tider, og som ikke krever databeregninger. For å sikre reproduserbarhet og riktig foton flux kvantifisering, må bildeenheten kalibreres med en lett referanse for hjemmelaget enheter eller som anbefalt av leverandøren for kommersielle enheter.

Vår protokollen krever nøye oppmerksomhet til flere kritiske points: (i) Først er avgjørende for å oppnå klare bilder, spesielt i tilfeller med lange eksponeringstider kvaliteten på mus anestesi. (Ii) Kvantifiseringen Enheten må være alltid være foton fluksen fordi utstråling er avhengig av overflatearealet til hver mus og kan være irrelevant for å sammenligne ulike mus. (Iii) bioluminescence Bildene må ikke inneholde mettede piksler, fordi disse ville skjevhet luminoscore. (iv) foran og bak oppkjøpet er pålagt å samle alle fotoner som sendes ut fra svulsten området (dvs. kan fram oppkjøpet ikke nødvendigvis oppdager fotoner fra baksiden av svulsten). Ulike ROI tegninger ble testet under utviklingen av den luminoscore metoden. Bare den manuelle påslag gitt tilfredsstillende resultater som er mer sannsynlig å være statistisk signifikant (data ikke vist).

Inoue et al. anbefaler en luciferin dose på 75 mg / kg ^13. Ved å bruke en dose på 150 mg / kg i stedet, tidspunktet for avbildning etterluciferin administrasjon forblir uendret og vi sørger for at platået varer gjennom en lang eksponering oppkjøpet. Luciferin må være det overskytende reaktant gjennom hele anskaffelsesprosessen. Avhengig av modell, kan regionen av interesse tilpasses, slik vi viste i SCL modell der vi trakk to ROI per dyr. I SCL-modell, er behandlingen injiseres når svulsten når 0,5 cm i sin største diameter for å begrense variabiliteten av engraftment. Avhengig av mus, kan tumoren vokst på en annen måte. For å standardisere og sammenligne mus, bestemte vi oss for å bruke et forhold mellom behandlet og ubehandlet side som viser den relative veksten av begge flanker svulster.

Dersom ikke noe signal observeres fra et injisert mus forventet å være positiv, enten (i) antall celler som er meget lavt og signalet er under deteksjonsgrensen; eller (ii) mus mangler oksygen og krever umiddelbar behandling.

Flere av de kvantitative biolumineschet analyser beskrevet av ulike forfattere krever komplekse beregninger og instrumenter (for eksempel 3D bioluminesens tomografi) å nærme seg den absolutte kvantifisering av slippes Bioluminescens fotoner ^5,15. Det er ingen enighet om en metode for å kvantifisere bioluminescence reproduserbart, spesielt i tumormodeller, med en 2D bioluminesens imager. Vårt mål var å standardisere bildet oppkjøpet protokollen for å begrense bruker avhengighet.

Injeksjon av CpG in situ etter tumorinokulasjon redusert tumorbyrde i begge modellene. Den luminoscore metoden kan fungere som et verktøy for å overvåke tumorbyrde i andre modeller av tumorimmunterapi. Overvåking tumorbelastning gir en ikke-invasiv metode som kan øke vår forståelse av tumorvekst og metastasering mekanismer uten å forstyrre svulsten mikromiljøet. Identifiseringen av dyr som ikke gjør det responderer på behandling med denne metode er forsterket ved verifisering av sVellykket tumorcelle-injeksjon ved begynnelsen av forsøket.

Vi her viste omstillingsevnen i luminoscore metoden i en SCL modellen ved hjelp A20.IIA-luc2 celler. Imidlertid kan denne fremgangsmåte tilpasses til en hvilken som helst annen tumormodell ved å bruke andre cellelinjer, forutsatt at de uttrykker luciferase, eller i sammenheng med T-cellestudier (tumorspesifikke cytotoksiske T-celler, regulatoriske T-celler, etc.). Overvåkingen av in vivo genoverføring i sammenheng med genterapi av sjeldne sykdom kan også gjøres ved hjelp av luminoscore metode.

Endelig data viser at bioluminescence baserte luminoscore metoden gjør sammenligninger mellom eksperimenter, og tilbyr fleksibilitet og tilpasningsevne til bestemte eksperimentelle behov, og er et nyttig verktøy for ikke-invasiv longitudinelle prekliniske studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CpG 1826	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826
ODN 1826 control	Invivogen	Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c
D-luciferin potassium salt	Interchim	Catalog number: FP-M1224D
Ketamin	Virbac, France
Xylazin	Bayer Healthcare	Rompun 2%
A20.IIA-luc2 cell line		A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)
Mice	Balb/cByj	Six-weeks old females from Charles River
IVIS lumina Biolumienscence imager	Perkin Elmer
Living Image software	Perkin Elmer	Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs
R software (opensource)	R-project	Used for statistic tests
Hamilton Precision Serynge 10 µl	Hamilton	Product number 7642-01100
Eye ointment	Lacrinorm
Dissecting microscope	ZEISS	Stemi 305