ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
我々は、開発中に、鳥類の胚によって栄養利用を媒介に特定の酵素やタンパク質の機能を研究するための内胚葉上皮細胞培養モデル（EEC）を設立しました。受精したウズラの卵を、5日間37℃でインキュベートし、次いで嚢膜（YSM）がEEC培養システムを確立するために収集された卵黄ました。我々はYSMから胚の胚葉層を単離し、そして2内膜をスライス – 3mmの小片と部分的に24ウェル培養プレートに播種する前に、コラゲナーゼで消化しました。 EECSは、組織の外に増殖し、細胞培養研究のための準備ができています。我々は、ステロールO-アシルトランスフェラーゼ、およびリポタンパク質リパーゼの発現、例えば、EECSがインビボで YSMの典型的な特徴を有していること脂肪滴の蓄積を見出しました。部分的消化処理が大幅EEC文化の成功率を増加させました。 EECSを利用して、我々はSOAT1の発現がcAMPのDによって調節されることを実証しましたependentタンパク質は、関連経路キナーゼ。このプライマリ日本ウズラEEC培養システムは、胚脂質輸送を研究すると鳥類の胚発生の間YSMに栄養利用を媒介に関与する遺伝子の役割を明確にするために便利なツールです。
Introduction
鳥類胚の主要な栄養リソースは、胚発生の間に33％脂質、17％のタンパク質、および1％の灰分から成る卵黄、。1で、卵黄嚢膜（YSM）は、胚腹腔内から成長し、次第に卵黄をカバー表面。胚2日目で開始し、脂質代謝と血管新生に関連した遺伝子発現が徐々にYSMに増加し、YSMはゆっくり絨毛状突起を開発しています。8,9これらの予測は、胚発生をサポートするために、卵黄の栄養素の吸収を増加させます。 YSMは、三胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉が含まれている胚体外組織である。14卵黄嚢の外胚葉は優しく卵黄嚢をカバーするために卵黄膜と卵白とリンクに直面しています。内胚葉上皮細胞は、卵黄に向かって直接直面し、などの栄養素の利用ポータルを提供しています。6 YSMが拡大するにつれて、内胚葉上皮細胞（EECS）SHAPによって分割することができています二つのグループ、地域の卵黄と血管野にeと機能性。7
エリア卵黄は、内胚葉細胞で構成され、胚から遠いです。血管野は、中胚葉細胞で構成され、血管や結合組織に分化さEECSを覆っています。胚5日目までに、卵黄を完全にYSMの外胚葉と内胚葉で覆われていると血管領域が急速に成長してきました。 YSMは、胚の循環系に、吸収し再構成すると解放（卵黄由来の超低密度リポタンパク質など）、脂質やタンパク質。9、2はしたがって、我々は脂質のメカニズムを研究するために、主要な日本のウズラ胚性内胚葉上皮細胞培養系を確立しました鳥類の胚発生時のYSMで利用。
このようなトリアシルグリセロール、レシチン、リン脂質とコレステロールエステル（CE）などの脂質は、鳥類の胚のための一次エネルギー源です。開発の初期段階で、卵黄脂質は、Cでありますわずか1.3％のCEのomposed、それは鳥類の胚発生3、11の中期で10から15%に上昇する。コレステロールエステルは、鳥類の胚YSMにステロールO-アシルトランスフェラーゼ1（SOAT1）によってコレステロールから合成される。4
コレステロールの貯蔵形態は、CE、CEはリポタンパク質で運ばれており、リポタンパク質は、組織への循環によって輸送される。13週ハッチの前に鳥類の胚の急速な成長があります。約卵黄の残りの脂質含有量の68％は、この段階で吸収される。10脂質はEEC研究モデルによって明らかにすることができる利用されている卵黄れる機構。鶏のEEC培養プロトコルは、この研究の目標を達成するために設立されました。2、9しかし、改善されたEEC細胞培養手順はによって栄養利用を媒介に特定の酵素やタンパク質の機能を研究するために必要とされる組織外植片の低い成功率に開発中に鳥類の胚。
Protocol
Representative Results
Discussion
前培養系のみ限定された成功を有しているので、より良好な培養系が必要です。日本ウズラYSM内胚葉は、ex vivoでの外植片でより良い成長の性能を達成するために、細胞間結合を緩めコラゲナーゼのようなタンパク質分解酵素で処理することが必要です。我々のデータは、部分消化処理の細胞数は、2日間（ 図1）のために播種した後、未消化組織培養からより大きかったことを示?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
現在のプロトコルの開発のための資金調達、特に国立台湾大学の「トップ大学の計画のねらい」によってサポートされ、台湾（グラントID-104R350144）、ならびに台湾の科学技術省（グラントID：MOST 104 -2313-B-002から039-MY3）。我々は、特に現在の研究のための動物室と実験室のスペースを提供するために国立台湾大学のバイオテクノロジーセンターに感謝します。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E.D., Lee, H.Y., Ahn, D.U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292 – 3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J.A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W.J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088 – 1098 (2013).
- Ding, S.T., Nestor, K.E., Lilburn, M.S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374 – 382 (1995).
- Ding, S.T., Lilburn, M.S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460 – 1464 (2000).
- Ding, S.T., Lilburn, M.S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065 – 1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D.C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340 – 348 (1996).
- Mobbs, I.G. McMillan, D.B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287 – 309 (1979).
- Mobbs, I.G., McMillan, D.B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285 – 308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L.M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002 – 2010 (2011).
- Noble, R.C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107 – 140 (1990).
- Shand, J.H., West, D.W., McCartney, R.J., Noble, R.C., Speake, B.K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621 – 625 (1993).
- Speier, J.S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E.A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941 – 1949 (2012).
- Walzem, R.L., Hansen, R.J., Williams, D.L, Hamilton, R.L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S – 472S,ISSN: 0022-3166, (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K.M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229 – 238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H.Y., Chen, C.C., Chen, Y.J., Lin, Y.Y., Mersmann, H.J., Ding, S.T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y.Y. et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147 – 154 (2014).
