Первичный энтодермальная эпителиальной клетки культуры из желтка мембраны японского перепела Эмбрионы
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Мы установили энтодермальную эпителиальной модель клеточной культуры (EEC) для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование пищевых веществ эмбрионов птиц в процессе разработки. Оплодотворенные Японские перепелиные яйца инкубировали при 37 ° С в течение 5 дней, а затем желток собирали мешка мембраны (YSM) установить ЕЭС систему культуры. Мы выделили эмбриональную энтодермы слой из YSM, и разрезали мембрану в 2 – 3 мм кусочки и частично переваривают коллагеназы перед посевом в 24-луночные культуральные планшеты. ОЦОД пролиферируют из ткани и готовы для проведения исследований на клеточных культурах. Мы обнаружили , что ОЦОД имели типичные характеристики YSM в естественных условиях, например, накопление липидных капель, экспрессия стерол O-ацилтрансферазы и липазы липопротеинов. Частичное лечение пищеварение значительно увеличило успешную ставку ЕЕС культуры. Используя EECS, мы показали, что экспрессия SOAT1 регулируется цАМФ гependent протеинкиназы связанный путь. Эта первичная японская система перепела ЕЕС культура является полезным инструментом для изучения эмбриональных липидный транспортировки и уточнить роль генов, участвующих в опосредовании использования питательных веществ в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Introduction
Основной питательный ресурс птичьего эмбриона желток, состоящий из 33% липидов, 17% белка, и 1% золы. 1 Во время эмбрионального развития желточный мешок мембрана (YSM) растет изнутри эмбриональном брюшной полости и постепенно охватывает желток поверхность. Начиная со 2 -й день эмбрионального, экспрессия генов , связанные с липидного обмена и ангиогенеза постепенно увеличивается в YSM и YSM развивается медленно ворсинок выступы. 8,9 Эти прогнозы увеличивают всасывание питательных веществ желтка для поддержки эмбрионального развития. YSM является внезародышевый ткани , которая содержит три зародышевых листка, энтодермы, мезодермы и эктодермы. 14 желточный мешок эктодерма лица белке и связи с желточной оболочки , чтобы мягко покрыть желтка. Энтодермальные эпителиальные клетки сталкиваются непосредственно к яичным желтком и служат в качестве питательных порталов утилизации. 6 По мере расширения YSM, энтодермальную эпителиальной клетки (EECS) можно разделить на Шапе и функциональность на две группы, площадь желточными и площадь vasculosa. 7
Площадь желточная состоит из клеток эндодермы и отстоит от эмбриона; Площадь vasculosa состоит из клеток мезодермы и охватывает дифференцированные EECS с кровеносных сосудов и соединительной ткани. Эмбриональным 5-й день, желток полностью покрыта эктодермы и энтодермы из YSM и сосудистый площадь быстро растет. YSM поглощает, recomposes и освобождает липиды (как желток происхождения липопротеинов очень низкой плотности) и белков в эмбриональном кровеносную систему. 9, 2 Таким образом, мы установили первичный японский перепел эмбриональных энтодермальную эпителиальной системы культивирования клеток, чтобы изучить механизмы липида использование в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Липиды, такие как триацилглицерина, лецитина, фосфолипидов и эфиров холестерина (СЕ) являются основными источниками энергии для эмбрионов птиц. На ранних стадиях развития, желток липиды сomposed из всего лишь 1,3% CE и повышается до 10-15% в среднесрочной перспективе птичьего эмбрионального развития 3, 11 Сложный эфир холестерина. синтезируется из холестерина стерол O-ацилтрансферазы 1 (SOAT1) в области птичьего эмбриона YSM. 4
Форма хранения холестерина CE, CE осуществляется в липопротеинов и липопротеины транспортируется циркуляционной к тканям. 13 За неделю до люка происходит быстрый рост эмбрионов птиц. Примерно 68% из оставшихся содержание липидов в желтке всасываются во время этой стадии. 10 Механизм , посредством которого желток липиды используются могут быть уточнены с помощью ЕЕС исследовательской модели. Протокол культура курица ЕЕС была создана для достижения этой цели исследования. 2, 9 Тем не менее, из – за низкой вероятностью успеха эксплантов ткани усовершенствованную процедуру ЕЕС культивирования клеток необходима для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование питательных веществ путем эмбрионов птиц в процессе разработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку предыдущая система культура имеет лишь ограниченный успех, необходима лучшая система культуры. Японский перепел YSM эндодермы требует лечения протеолитических ферментов, таких как коллагеназы, чтобы ослабить межклеточных соединений для достижения более высокой производит?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование разработки текущего протокола, в частности, при поддержке "Цель для плана Top университет" Национального университета Тайваня, Тайвань (грант ID-104R350144), а также Министерства науки и технологий Тайваня (грант ID: НАИБОЛЕЕ 104 -2313-B-002-039-MY3). Мы особенно благодарим центр биотехнологии Национального университета Тайваня за предоставление комнаты животных и лабораторных помещений для текущего исследования.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E.D., Lee, H.Y., Ahn, D.U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292 – 3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J.A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W.J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088 – 1098 (2013).
- Ding, S.T., Nestor, K.E., Lilburn, M.S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374 – 382 (1995).
- Ding, S.T., Lilburn, M.S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460 – 1464 (2000).
- Ding, S.T., Lilburn, M.S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065 – 1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D.C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340 – 348 (1996).
- Mobbs, I.G. McMillan, D.B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287 – 309 (1979).
- Mobbs, I.G., McMillan, D.B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285 – 308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L.M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002 – 2010 (2011).
- Noble, R.C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107 – 140 (1990).
- Shand, J.H., West, D.W., McCartney, R.J., Noble, R.C., Speake, B.K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621 – 625 (1993).
- Speier, J.S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E.A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941 – 1949 (2012).
- Walzem, R.L., Hansen, R.J., Williams, D.L, Hamilton, R.L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S – 472S,ISSN: 0022-3166, (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K.M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229 – 238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H.Y., Chen, C.C., Chen, Y.J., Lin, Y.Y., Mersmann, H.J., Ding, S.T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y.Y. et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147 – 154 (2014).
