Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Wir gründeten eine endodermaler epithelialen Zellkulturmodell (EWG) für die Funktion bestimmter Enzyme zu studieren und Proteine, die in Nährstoffverwertung von Vogelembryonen während der Entwicklung zu vermitteln. Befruchtete japanischen Wachteleier wurden für 5 Tage bei 37 ° C inkubiert und dann Dottersackmembranen (YSM) gesammelt wurden die EWG-Kultursystem zu etablieren. Wir isolierten die embryonale Endoderm Schicht aus YSM und in Scheiben geschnitten, die Membran in 2 – 3 mm Stücke und teilweise mit Kollagenase verdaut, bevor sie in 24-Well-Kulturplatten mit Animpfen. Die EECs proliferieren aus dem Gewebe und sind für die Zellkultur-Studien bereit. Wir fanden , dass die EECs typischen Eigenschaften YSM in vivo hatten, beispielsweise Akkumulation von Lipidtröpfchen, die Expression von Sterol O-Acyltransferase und Lipoprotein – Lipase. Die partielle Verdauung Behandlung signifikant erhöht die erfolgreiche Rate der EWG Kultur. Verwendung der EECs haben wir gezeigt, dass die Expression von SOAT1 durch die cAMP d reguliert wurdeependent Protein-A-verwandten Weg Kinase. Diese primäre japanische Wachtel EWG Kultursystem ist ein nützliches Werkzeug embryonale Lipidtransport zu untersuchen und die Rolle der Gene bei der Vermittlung der Nährstoffverwertung in YSM während avian Embryonalentwicklung beteiligt zu klären.
Introduction
Der Hauptnahrungsressource des Vogelembryo yolk ist, bestehend aus 33% Lipiden, 17% Protein und 1% Asche. 1 Während der embryonalen Entwicklung, der Dottersack – Membran (YSM) wächst aus der embryonalen Bauchhöhle und erstreckt sich allmählich das Eigelb Oberfläche. Beginnend am embryonalen Tag 2, die Genexpression , die mit Lipid – Metabolismus und die Angiogenese wird in YSM allmählich erhöht, und die YSM entwickelt sich langsam villus artige Vorsprünge. 8,9 Diese Vorsprünge erhöhen die Absorption von Nährstoffen yolk embryonalen Entwicklung zu unterstützen. Die YSM ist ein extraembryonic Gewebe , das drei Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ektoderm enthält. 14 Der Dottersack ectoderm steht das Eiweiss und Verbindungen mit der Dotterhaut vorsichtig auf die Dottersack abzudecken. Die endodermaler Epithelzellen direkt auf das Eigelb und dienen als Nährstoffverwertung Portale konfrontiert. 6 Wie der YSM erweitert, endodermaler Epithelzelle (EECs) durch shap unterteilt werdene und Funktionalität in zwei Gruppen, Bereich Dotter und Bereich vasculosa. 7
Gebiet vitelline besteht aus Entodermzellen und ist weit entfernt von dem Embryo; Bereich vasculosa aus mesodermalen Zellen zusammengesetzt und umfasst differenzierte EECs mit Blutgefäßen und Bindegewebe. Durch die embryonale Tag 5 wird das Eigelb vollständig von Ektoderm und Entoderm von YSM bedeckt und das Gefäßbereich ist schnell gewachsen. Die YSM absorbiert, neu zusammensetzt und gibt Lipiden (wie Eigelb abgeleitetes Lipoprotein sehr niedriger Dichte) und Proteine in die embryonalen Kreislaufsystem. 9, 2 Daher wir eine primäre japanischen Wachteln embryonalen endodermalen epithelialen Zellkultur – System, die Mechanismen von Lipid zu studieren Nutzung in YSM während aviären embryonalen Entwicklung.
Lipids wie Triacylglycerol, Lecithin, Phospholipid und Cholesterinester (CE) sind die primären Energiequellen für Vogelembryonen. In den frühen Stadien der Entwicklung, yolk Lipide sind Cin Vogelembryo YSM omposed von nur 1,3% CE und es steigt auf 10-15% bei Halbzeit der aviären Embryonalentwicklung 3, 11. Cholesterinester wird aus Cholesterin durch Sterin O-Acyltransferase 1 (SOAT1) synthetisiert. 4
Die Speicherform von Cholesterin ist CE, CE in Lipoproteinen getragen wird, und Lipoproteine durch Zirkulation zu den Geweben transportiert werden. 13 Eine Woche vor Luke dort schnelle Wachstum von Vogelembryonen ist. Etwa 68% der verbleibenden Lipidgehalte in Eigelb werden in dieser Phase absorbiert. 10 Der Mechanismus , mit dem Eigelb Lipide verwendet werden , können durch eine EWG – Forschungsmodell geklärt werden. Ein Huhn EWG Kulturprotokoll wurde festgestellt , diese Forschungsziel zu erreichen. 2, 9 jedoch aufgrund der geringen Erfolgsrate von Gewebeexplantaten wird eine verbesserte EWG Zellkulturverfahren benötigt , um die Funktion bestimmter Enzyme und Proteine , die in der Vermittlung Nährstoffausnutzung zu untersuchen , indem Vogelembryos während der Entwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da die vorherige Kultursystem nur begrenzten Erfolg hat, wird eine bessere Kultursystem erforderlich. Die japanische Wachtel YSM endoderm erfordert eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase, die Zell-Zell-Verbindungen zu lösen bessere Wachstumsleistung in den ex-vivo-Explantate zu erreichen. Unsere Daten zeigen , dass die Zellzahlen von partiellen Verdau Behandlung waren größer als der unverdauten Gewebekultur nach 2 Tagen nach der Aussaat (Abbildung 1). Daher ist die partielle prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung für die Entwicklung des aktuellen Protokolls ist vor allem durch "Ziel für die Top-Universität Plan" von der National Taiwan University, Taiwan (Zuschuss ID-104R350144) sowie das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (Erteilungs ID unterstützt: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Wir danken vor allem das Zentrum für Biotechnologie der National Taiwan University zur Bereitstellung eines Tierraum und Laborflächen für die aktuelle Studie.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
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