Primaria endodermico cellule epiteliali Cultura dal tuorlo Sac membrana di giapponesi Quail embrioni
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Abbiamo stabilito un endodermico epiteliale modello di coltura cellulare (CEE) per studiare la funzione di alcuni enzimi e proteine nel mediare l'utilizzo dei nutrienti da embrioni aviaria durante lo sviluppo. Fecondate uova di quaglia giapponesi sono state incubate a 37 ° C per 5 giorni e poi tuorlo membrane SAC (YSM) sono stati raccolti per stabilire il sistema di coltura CEE. Abbiamo isolato lo strato endoderma embrionale da YSM, e affettato la membrana in 2 – 3 pezzi mm e parzialmente digerito con collagenasi prima della semina in piastre di coltura da 24 pozzetti. Il TEE proliferano fuori del tessuto e sono pronti per studi su colture cellulari. Abbiamo trovato che il TEE aveva caratteristiche tipiche di YSM in vivo, per esempio, l'accumulo di gocce lipidiche, espressione di steroli O-aciltransferasi e lipoproteina lipasi. Il trattamento di digestione parziale significativamente aumentato il tasso di successo della cultura CEE. Utilizzando il TEE, abbiamo dimostrato che l'espressione di SOAT1 è stata regolata dal cAMP dla proteina chinasi A ependent percorso relativo. Questo sistema di coltura quaglia CEE giapponese primario è uno strumento utile per lo studio embrionale trasporto dei lipidi e di chiarire il ruolo dei geni coinvolti nella mediazione di utilizzo dei nutrienti nel YSM durante lo sviluppo embrionale aviaria.
Introduction
La principale risorsa alimentare dell'embrione aviaria è tuorlo, composto da 33% di lipidi, proteine 17% e 1% di ceneri. 1 Durante lo sviluppo embrionale, la membrana sacco vitellino (YSM) cresce all'interno della cavità addominale embrionale e copre gradualmente il tuorlo superficie. Con inizio alle embrionali giorno 2, l'espressione del gene associato con il metabolismo dei lipidi e l'angiogenesi è gradualmente aumentata in YSM, e il YSM sviluppa lentamente proiezioni villi-like. 8,9 Queste proiezioni aumentano l'assorbimento delle sostanze nutritive tuorlo per sostenere lo sviluppo embrionale. Il YSM è un tessuto extraembryonic che contiene tre strati germinali, endoderma, mesoderma ed ectoderma. 14 Il ectoderma sacco vitellino si trova di fronte l'albume e collegamenti con la membrana vitellina per coprire delicatamente il sacco vitellino. Le cellule epiteliali endodermico si trovano ad affrontare direttamente verso il tuorlo d'uovo e servono come portali di utilizzo di nutrienti. 6 Come si espande il YSM, endodermico cellule epiteliali (TEE) può essere diviso per ShapE e funzionalità in due gruppi, zona vitellina e zona vasculosa. 7
Area vitellina è composto da cellule endodermico ed è distante dalla dell'embrione; zona vasculosa è composto da cellule mesodermiche e copre TEE differenziati con i vasi sanguigni e dei tessuti connettivi. Di embrionali giorno 5, il tuorlo è totalmente coperto da ectoderma e endoderma di YSM e l'area vascolare è cresciuto rapidamente. Il YSM assorbe, ricompone e rilascia i lipidi (come il tuorlo di derivazione molto lipoproteine a bassa densità) e le proteine nel sistema circolatorio embrionale. 9, 2 Pertanto, abbiamo stabilito un embrionale sistema di coltura cellulare primaria giapponese quaglie endodermico epiteliale, per studiare i meccanismi di lipidi utilizzo in YSM durante lo sviluppo embrionale aviaria.
I lipidi quali trigliceridi, lecitina, fosfolipidi e colesterolo estere (CE) sono le fonti di energia primaria per gli embrioni aviaria. Nelle prime fasi di sviluppo, lipidi tuorlo sono composed di solo l'1,3% del CE e sale al 10-15% a medio termine della aviaria sviluppo embrionale 3, 11. estere Il colesterolo è sintetizzato dal colesterolo da steroli O-aciltransferasi 1 (SOAT1) in aviario YSM embrionale. 4
La forma di colesterolo stoccaggio è CE, CE viene effettuata in lipoproteine, e lipoproteine vengono trasportati dalla circolazione ai tessuti. 13 Una settimana prima portello c'è una rapida crescita degli embrioni aviaria. Circa il 68% delle restanti contenuti di lipidi nel tuorlo vengono assorbiti durante questa fase. 10 Il meccanismo con cui tuorlo lipidi vengono utilizzati possono essere chiarita da un modello di ricerca CEE. Un protocollo cultura pollo CEE è stato creato per raggiungere questo obiettivo di ricerca. 2, 9 Tuttavia, a causa del basso tasso di successo di espianti di tessuto, è necessario un procedimento di coltura cellulare CEE per studiare la funzione di alcuni enzimi e proteine nel mediare utilizzazione nutriente embrioni aviaria durante lo sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poiché il sistema di coltura precedente ha solo un successo limitato, è necessario un sistema di coltura migliore. L'endoderma quaglie YSM giapponese richiede un trattamento con enzimi proteolitici, come collagenasi per allentare le giunzioni cellula-cellula per ottenere una migliore performance di crescita negli espianti ex-vivo. I nostri dati mostrano che il numero di cellule derivanti dal trattamento di digestione parziale sono stati superiori dalla coltura tissutale non digerito dopo la semina per 2 giorni <st…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per lo sviluppo del protocollo attuale è sostenuta in particolare da "Obiettivo per il Piano Top Università" della National Taiwan University, Taiwan (grant ID-104R350144), così come il Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (grant ID: PIU '104 -2313-B-002-039-MY3). Ringraziamo in modo particolare il Centro di Biotecnologie della National Taiwan University per fornire un ambiente animale e spazio laboratorio per lo studio corrente.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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